Mis Zambağının (Lilium Candidum) Biyokimyasal Aktivitelerinin Belirlenmesi ve Endüstriyel Amaçlı Kullanılabilirliğinin Araştırılması
Bu çalışmada, Muğla kırsalında yetişen Lilium candidum çiçekleri Mayıs-Haziran aylarında toplanmışve bazıbiyokimyasal aktiviteleri araştırılmıştır. Proteaz enzimleri proteinlerin peptitlere ve amino asitlere hidrolizini katalizler. Hem endüstriyel hem de biyokimyasal uygulamalarda en önemli enzim gruplarından biridir.
Lilium candidum çiçeklerinden proteaz enzimi saflaştırmak için (NH4)2SO4 çöktürmesi ve CM-Sephadex iyon değişim kromotografisi kullanıldı. Enzimin optimum pHve optimum sıcaklık değerleri ve kazein, azokazaein, jelatin, hemoglobin, azoalbümin substratlarıiçin KM ve Vmax değerleri belirlendi.
Saflaştırılan proteaz enziminin saflığınıkontrol etmek için SDS-PAGE kullanıldı. Jel filtrasyon kromatografisi kullanılarak enzimin molekül ağırlığının 29,7 kDa olduğu hesaplandı.
Enzim aktivitesi üzerine Hg2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+, Fe3+, Ni2+, Mg2+ (10mM, 1mM, 0,1mM) katyonlarının ve EDTA, SDS, β-merkapto etanol ve iyodasetamit bileşiklerinin etkileri de incelendi.
Lilium candidum çiçeklerinin içerdiği vitamin A, vitamin E ve vitamin C miktarları sırasıyla (64
±0.23
μg/100 mg), (36
±0,15
μg/100 g), (16
±0,32 mg/100 g) olarak belirlendi.
Fenolik bileşikler, B grubu vitaminleri ve serbest amino asit içeriği UPLC-ESI-MS/MS metodu ile belirlendi. Uçucu ve aroma verici bileşenler Headspace GC/MSD metodu ile analiz edildi.
Lilium candidum çiçeklerinden elde edilen üçfarklıekstrenin (hekzan, etil asetat ve etil alkol fraksiyonları) antioksidan aktiviteleri de belirlendi. Bu amaçla toplam antioksidan, DPPH serbest radikali giderimi ve ABTS katyon radikali giderimi aktiviteleri belirlendi.
Elde edilen sonuçlardan lilium candidum çiçeklerinin fenolik bileşikler bakımından zengin olduğu anlaşıldı. Kaempferol ve Ferrulik asitin lilium candidum çiçeklerinde çok miktarda bulunduğu tespit edildi.
Çiçeklerin 100 gramında, sırasıyla fenilalanin (568
μg), izolösin (547
μg), triptofan (520
μg), valin (275
μg) ve lösin (81
μg) esansiyel amino asitleri de bulundu.
Bu araştırmanın sonuçlarına göre, lilium candidum çiçeklerinin, proteaz enzimlerini, tüm serbest amino asitleri, aroma bileşiklerini, vitaminleri (A, C, E ve B grubu) ve fenolik bileşikleri içerdiği anlaşılmıştır. Bu zengin içeriğinden dolayı çiçeğin ilaç ve kozmetik sektöründe önemli bir kaynak olacağı sonucuna varılmıştır.
Giriş
Kozmetiğin Tarihçesi
Kozmetik insanlığın doğuşu ile başlar. Başlangıcı Adem ve Havva
’ya dayanır. Bu ifade insanlarda güzel olma ve bakımlılık konusunun ne kadar önemli olduğunu gösterir. İnsanlar bitkilerin, yağların ve iksirlerin iyileştirici ve güzelleştirici özelliklerinden uzun zamandır yararlanmaktadır.
Bitkilerle beslenmiş, tedavi olmuş ve hayatta kalmışlardır. Doğal yaşam anlayışı, nesilden nesile aktarılarak bugünlere gelmiş ve günümüzde bir yaşam stili halini almıştır.
Doğal ürünleri tüketmek, doğal kozmetik malzemeleriyle kişisel bakım yapmak, gıda takviyelerini almak kentli yaşamın ayrılmaz bir parçası olmuştur. Bunların hepsi doğal ve sağlıklı yaşam için vazgeçilmez unsurlardır.
Doğal kozmetikler, doğal maddeler yardımıyla insan vücudunun bakımını ve sağlıklı bir şekilde güzelleşmesini amaçlar. Bu da cilde ve çevreye dost maddelerle sağlanabilir. Doğal kozmetik, cilt fonksiyonlarımıza yardım eder ve canlandırır. Yumuşak bir bakım sağlar ve her yaştaki cildin sağlıklı kalmasına yardımcı olur.
Doğal kozmetik, vücut ve ruhun uyumunun sağlanmasına katkıda bulunur. Yaşamın kaynağı olan doğa, bize sağlıklı ve uzun bir hayat sürebilmemiz için gerekli olan her şeyi sunmaktadır. Önemli olan farkında olmaktır.
Lilium Bitkisinin Özellikleri
Liliacea familyasından olan bitki ılıman Asya, Avrupa ve Kuzey Amerika
’da yayılış gösterir. Dünyada yaklaşık 100
’ün üzerinde türü olduğu bilinmektedir. Türkiye
’de bu çiçeğin 5 türü, 1 alt türü ve 4 varyatesi tespit edilmiştir (Smyth vd., 1980).
Bitkinin ülkemizdeki türleri Lilium candidum (Akzambak), Lilium martagon (Türk zambağı), Lilium carniolicum, Lilium ciliatum (Kirpikli zambak), Lilium monadelphumdur. Bitkinin 10 farklı türü de Avrupa florasında tanımlanmıştır (Tutin vd., 1980).
Lilium Candidum’un (Mis Zambağının) Genel Özellikleri
Gövdesi 50-130 cm yüksekliğindedir. Çiçekleri huni şeklinde olup kar beyazı renginde ve 2-12 çiçeklidir. Yapraklar spiral dizilişli, parlak ve tüysüdür. Flamentler 45- 50, nadiren 57 mm, anterler ise 9-11 mm olup polenleri altın sarısıdır.
Stilüs 35-50, nadiren 60 mm uzunluğundadır. Çiçeklenme zamanı Mayıs ayıdır (Davis, 1984). Bitki, kumlu ve taşlı topraklarda, taşlı ormanlık alanlarda ve çimenli yerlerde, 10-1300 m arası yüksekliklerde yayılış gösterir (Davis, 1984).
Lilium candidum çok yıllık bir bitkidir. Bitkinin soğanı sarımsı beyaz renkli, çiçekleri çok keskin kokuludur.
Bahçelerde süs bitkisi olarak yetiştirildiği gibi Batı Anadolu
’da (İzmir, Karaburun, Söke-Bafra Gölü, Marmaris- Bozburun) yabani olarak da yetişir. Lilium candidumun soğanları idrar arttırıcı, balgam söktürücü ve çıban olgunlaştırıcı olarak kullanılmaktadır.
Eskiden beri çiçeklerinden kokulu maddeler elde etmek amacıyla BatıAnadolu
’da yetiştirilmektedir. Günümüzde özellikle süs bitkisi olarak yetiştirilmekte ve soğanları dış ülkelere ihraç edilmektedir.
Su buharı distilasyonu ile çiçeklerinden elde edilen suyu cilt lekelerinin ve sivilcelerin tedavisinde kullanılır. Çiçeğin zeytinyağı içinde tutulması ile elde edilen ekstrakt koku verici olarak kullanılır.
Çiçeğin diğer isimleri mis zambağı, akzambak, bey zambağı (Marmaris civarında) ve beyaz zambaktır (Baytop, 1984). Proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterize edilmesi ile bu çiçeğin kozmetik, gıda ve ilaç endüstrilerinde kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.
Uçucu bileşenler ve vitamince zengin olmasızambağın kozmetik endüstrisinde kullanılabileceğini düşündürmektedir.
Materyal ve Yöntem
Bitkinin Ekstraksiyonu
Lilium candidum çiçekleri küçük parçalara ayrıldıktan sonra metanolle ekstrakte edildi. Bitkinin çiçekleri metanol içinde her seferinde 24 saat bekletilerek, toplam 5 defa ekstrakte edildi. Metanol rotary evapotatörde buharlaştırıldı.
Böylece ham ekstre elde edilmişoldu. Elde edilen metanol ekstresi suda çözüldü. Hekzan ve etil asetatla geri ekstraksiyon yapıldı. Daha sonra çözücüler
uçurularak, her bir çözücüye ait ham ekstreler elde edildi. Bu işlemlerden geriye kalan kısma su fraksiyonu denildi. Bu çözeltideki su liyofilizatör kullanılarak uzaklaştırıldı. Bu ekstre ve fraksiyonların miktarlarıtartılarak belirlendi.
UPLC-MS/MS ile Fenolik Bileşiklerin Tayini
3 g lilium candidum çiçeği 200 mL sıvı azot ile parçalandı. Üzerine 30 mL aseton-su (80:20) karışımı ilave edildi ve 6 saat bekletildi (-86
°C
’de). Karışım soğutucudan çıkarıldı, ultrasonik banyoda 15 dakika tutuldu daha sonra, 4000 rpm
’de 10 dakika santrifüjlendi (20
°C
’de).
Süzme işleminden sonra kalıntı iki kez 30 mL
’lik aseton-su karışımı ile ekstrakte edildi. Ekstraktlar birleştirildi ve aseton evaporatörde uzaklaştırıldı.
Sulu faz, n-hekzan ve dietileter ile yıkandı. Daha sonra üç kez 30 mL etilasetat ile ekstrakte edildi. Ekstraktlar birleştirildi. Etil asetat buharlaştırıldı ve kalıntı sumetanol (80:20) karışımında çözüldü.
Çözelti 0,20
μm filtrelerden (Macherey-Nagel Chromafil Xtra PTFE-20/25) geçirildi. UPLC-MS/MS (Waters Acquity Ultra Performance LC, Xevo TQ-S MS-MS) cihazı ile analiz edildi.
UPLC-MS/MS ile Serbest Amino Asit İçeriğinin Belirlenmesi
Lilium candidum çiçeği küçük parçalara ayrıldıktan sonra liyofilizatörde 12 saat kurutuldu. Homojen örneküzerine (1 g) su-metanol-formik asit çözeltisi (80-19,9-0,1, v/v/v, 5 mL) ilave edildi.
Karışım 10 dakika karıştırıldıktan sonra 10 dakika 14000 rpm de santrifüjlendi (4
°C de). Üst kısım 0,20
μm filtreden (Macherey-Nagel Chromafil Xtra PTFE-20/25) süzüldüve UPLC-MS/MS (Waters Acquity Ultra Performance LC, Xevo TQ-S MS-MS) cihazı ile analiz edildi.
Cihaz Parametreleri Fenolik Bileşiklerde kullanılan değerler ile aynıdır.
Lilium Candidum Çiçeklerinin Uçucu Bileşenlerin Headspace GC/MSD ile Belirlenmesi
Parçalanmıştaze lilium candidum çiçekleri 20 mL
’lik headspace vialinde tartıldı(5 g). Daha sonra üzerine susuz magnezyum sülfat (MgSO4) ilave edildi ve karıştırıldı.
Vial cihazın örnekleyicisine yerleştirildi ve 90
°C
’de 30 dakika süreyle ekstrakte edildi. Daha sonra vialin üst kısmındaki uçucu bileşenler helyum gazı ile GC Split/ Splitless girişine transfer edildi.
B Vitamini İçeriğinin UPLC-MS/MS İle Belirlenmesi
Yaklaşık 3 g lilium candidum çiçeği parçalandıktan sonra üzerine 30 mL H2O-CH3CN (80:20) karışımıilave edildi ve soğutucuda 6 saat bekletildi (+4
°C
’de). Karışım ultrasonik banyoda 15 dakika tutulduktan sonra, 4000 rpm
’de 10 dakika santrifüjlendi (20
°C
’de).
Kalıntısüzüldükten sonra iki defa daha 30 mL
’lik H2O-CH3CN karışımıile ekstrakte edildi. Birleştirilen çözeltideki asetonitril evaporatörde buharlaştırıldı(40oC
’de).
Çözelti 0,20
μm
’lik filtreden (Macherey-Nagel Chromafil Xtra PTFE-20/25) geçirildi ve UPLC-MS/MS (Waters Acquity Ultra Performance LC, Xevo TQ-S MS-MS) cihazıile analiz edildi.
Antioksidan Aktivite Belirleme Yöntemleri
Toplam Antioksidan Aktivite: β-Karotenin Renginin Açılması Yöntemi
Toplam antioksidan aktivite, linoleik asit oksidasyonundan ileri gelen konjuge dien hidro peroksitlerinin inhibisyonunun ölçülmesine dayanan β-karoten-linoleik asit yöntemiyle belirlendi (Miller, 1971).
Bu yöntem, β-karotenin renginin açılmasına dayanır. 250 mL
’lik şilifli bir balonda, 0,5 mg β-karoten 1 mL kloroformda çözülür ve üzerine 200 mg Tween-40 ve 20
μL linoleik asit ilave edilir. Çözücü tamamen uzaklaştırılır. Kalıntının üzerine 100 mL oksijen ile doyurulmuş su ilave edilir ve çalkalanır.
0,5-4 mg arasında numune içeren 1 mL
’lik örneklerin üzerine 4 mL β-karoten karışımı ilave edilir. Emülsiyon, test tüplerine konulunca spektrofotometre kullanılarak başlangıç absorbansları ölçülür (β= 470 nm). Kontrol olarak metanol kullanılır.
Tüpler 50
°C
’de inkübasyona bırakılır ve kontrol tüpündeki β-karotenin rengi kayboluncaya kadar beklenir (yaklaşık 120 dk.). β-karotenin renginin kaybolma hızı (R) ve antioksidan aktivite (AA) hesaplanır.
DPPH Serbest Radikali Giderim Aktivitesi Yöntemi
Lilium candidum çiçeklerinin bu özelliği DPPH (1,1-difenil-2-pikril hidrazil) radikali kullanılarak belirlendi (Blois, 1958). 0,5-4 mg arasında ekstrakt içeren 1 mL
’lik örneklerin üzerine etanolde çözünmüş%0,004
’lük DPPH çözeltisinden 4 mL ilave edildi.
Kontrol olarak etanol kullanıldı. Numuneler oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildikten sonra absorbansları 517 nm
’de ölçüldü. Daha sonra serbest radikal giderim aktiviteleri hesaplandı.
ABTS Katyon Radikali Giderim Aktivitesi Yöntemi
Ekstrelerinin katyon radikali giderim aktiviteleri ABTS (2,20-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) kullanılarak belirlendi (Re vd., 1999). 7 mM ABTS 2,45 mM K2SO8 ile etkileştirilerek 5 mL ABTS radikali oluşturuldu. Bu karışım katyon radikalinin oluşması için 16 saat karanlıkta bekletildi.
Bu radikal çözeltisinden 1 mL alındı ve absorbansıetanol ile seyreltilerek yaklaşık 0,700
’ye ayarlandı. 0,5-4 mg arasında ekstrakt içeren 1 mL örneküzerine ABTS çözeltisinden 4 mL ilave edildi.
Kontrol olarak etanol kullanıldı. Oda sıcaklığında 10 dakika bekletildikten sonra absorbansları 734 nm
’de ölçüldü. ABTS katyon radikali giderim aktivitesi hesaplandı.
Prof. Dr. Nazan Demir / 1Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi - Kozmetik Ürünler Uygulama ve Araştırma Merkezi
Prof. Dr. Yaşar Demir / 1Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi - Kozmetik Ürünler Uygulama ve Araştırma Merkezi
Dr. Fatih Uçkaya / Bezmialem Üniversitesi Eczacılık Fakültesi
Araş. Gör. Ceyhun IŞIK / Y. Lisans Öğ. Sıla Nezahat Daşdemir- Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi Fen Fakültesi
