Poloksamer 188, topikal, oral ve parenteral uygulamalarda kullanılan farmasötik bir yardımcı maddedir. Bunun dışında, poloksamer 188 kesme gerilimlerine karşı çok etkili bir koruyucu olarak bilinmektedir ve 1980’li yılların sonlarında süspansiyon formundaki hücre kültürlerinin üretiminde kullanılmıştır. CHO hücre hattının kesme gerilim kuvvetlerine karşı olan aşırı hassasiyeti nedeniyle poloksamer 188 hammaddesinin monoklonal antikorların ve terapötik proteinlerin ticari üretimlerinde koruyucu olarak sıklıkla tercih edildiği görülmektedir.
Sadece %0.1 konsantrasyondaki poloksamer 188 kullanımı dahi hücre canlılığı ve büyüme hızında pozitif etkiler göstermektedir. Son yıllarda, biyofarmasötik endüstrisindeki kullanıcılardan bazılarının poloksamer 188 ürününün değişken performansına bağlı olarak problemler yaşadığı ve bunun da farmakopelerde yer alan ilgili monografların gereksinimlerini karşılama noktasında sorunlar yarattığı bildirilmektedir. Değişken performansa sahip olan hammaddeler ticari üretimlerde hücrelerin kesme geriliminden korunmasını ve hücresel ürünlerin titrelerini azaltmaktadır.
BASF, poloksamer 188 hammaddesini en başta oral veya topikal ilaçlar için yardımcı madde olarak pazara sunmuştur. Poloksamer 188’in biyolojik sistemlerde kullanımının öğrenilmesi ve endüstrideki bazı kullanıcılarla yapılan iş birlikleri sonucunda hücre kültürü üretiminde karşılaşılan değişken performansların kök nedenini bulmak amacıyla sistematik bir araştırma başlatılmıştır.
Elde edilen tecrübeler ve bilgiler ışığında gerekli kontroller uygulanarak hücre kültürü üretimleri için daha iyi ve tutarlı biyolojik performansa sahip poloksamer 188’in spesifik bir çeşidi geliştirilmiştir. Geliştirilen yeni tür poloksamer 188 hammaddesi hücre kültürü uygulamaları için özel olarak dizayn edilmiştir. Biyoteknoloji endüstrisindeki kullanıcıların ihtiyaçları göz önünde bulundurularak değişken performanslı ürün riskini azaltmak adına valide edilmiş bir temizlik prosedürü ve bir üretim metodu tasarlanmıştır ve bunun yanında da hücre kültürü testleri ve yeni kromatografik metot için analitik geliştirmeler yapılmıştır.
Bahsi geçen deneysel veri ve bilgiler, Felicitas Guth, Bastiaan Staal ve Tonya Jackson tarafından yayınlanan teknik doküman[1] esas alınarak düzenlenmiştir.
Poloksamer 188, ortalama molekül ağırlığı 8400 Da olan ve üç bloktan meydana gelen bir kopolimerdir. Şekil 1’de gösterildiği üzere orta kısımdaki polipropilen oksit yapısının sağında ve solunda etilen oksit blokları yer almaktadır. Hammadde anyonik polimerizasyon ile üretilmektedir ve monomerler olarak propilen oksit ile etilen oksit, başlatıcı olarak dietilen glikol ve katalizör olarak alkali hidroksit kullanılmaktadır. İlaç yardımcı maddesi olarak kalite standartları Avrupa farmakopesinde[2]
, Amerikan farmakopesinde[3] ve Japon farmasötik yardımcı madde dokümanında[4] tanımlanmıştır. Fizikokimyasal özellikleri Tablo 1’de [2,3,5] paylaşılmıştır. BASF tarafından üretilen Poloksamer 188 hammaddesi, Kolliphor P 188 ticari ismiyle pazarda yer almaktadır.
Poloksamer 188, irritasyona neden olmayan noniyonik bir sürfaktandır ve sulu çözeltilerinde tipik küçük miseller yerine nispeten büyük agregatlar meydana getirirler[6].
Birçok yayında, memeli hücrelerinin membranları ile polimerlerin etkileşim içerisinde olma eğilimlerinden bahsedilmektedir ve öneri olarak da stres koşulları altında stabilizasyonu sağlayıcı çözümler sunulmaktadır[7]. Poloksamer 188’in hücre kültürü üretimindeki koruyucu etkisinin sistematik bir şekilde değerlendirilmesi ile ilgili yayınlar ilk kez 1990’lı yıllarda yapılmıştır. Hücre kültürü üretimi sırasında biyoreaktörde meydana gelen kesme gerilimleri karıştırmadan ve oksijen beslemesinden kaynaklanmaktadır. Besleme sırasında meydana gelen oksijen kabarcıklarının yukarı çıkarak sıvı-gaz ara yüzeyinde patlaması sonucunda oluşan mekanik kuvvetler hücre parçalanmasına neden olmaktadır[8,9,10]. Poloksamer 188’in memeli hücreler üzerindeki stabilizatör ve faydalı etkisini açıklamak için fiziksel, mekanik ve biyolojik mekanizmalar önerilmiştir. Bazı araştırmacılar göre poloksamer 188 ortamda 1 g/L konsantrasyonda kullanıldığında sıvı-gaz ara yüzeyindeki gerilim düşmektedir ve gaz kabarcıkları ile hücrelerin arasındaki etkileşim azalmaktadır.
Sonuç olarak, hücreler reaktör içerisinde yükselen kabarcıklara daha az yapışarak üst kısımda biriken köpüklerin içerisinde daha az hapsolurlar ve mekanik kuvvetlerden daha iyi korunmuş olurlar[11]. Poloksamer 188’in gösterdiği sürfaktan etkisinin oluşan oksijen kabarcıklarının boyutlarını küçülttüğü ve böylece oksijenin kütle transferi üzerinde pozitif bir etki sağladığı gösterilmiştir[12]. Polimerin hücre membranlarına karşı yüksek afinitesi olduğu gözlemlenmiştir ve poloksamerin hidrofilik bir tabaka oluşturarak hücrenin fiziksel olarak stabilizasyonuna katkı sağladığı düşünülmektedir.
Bu etki, poloksamer uzaklaştırıldıktan sonra kalmadığından dolayı uzun dönemde biyolojik bir etkinin olması mümkün gözükmemektedir[13]. Poloksamer 188 konsantrasyonunun ne kadar artırılması ile ilgili olarak genel bir kullanım önerisi olmasa da %1-3 arasında[12,14] ve hatta %5 oranında[15] polimer kullanımının belirli reaktör türleri ve test koşulları için avantaj sağladığı belirtilmiştir. Optimum miktar prosese göre spesifik olarak belirlenebilir ve bu süreçte sadece üst akım prosesi gereksinimleri değil aynı zamanda alt akımdaki saflaştırma prosesleri de dikkate alınmalıdır.
Diğer poloksamer türleri[16], polietilen glikol[10], metil selüloz[17], veya alkil maltopiranozit[18,19], hammaddeleri de bu kapsamda test edilmiştir ve önerilmiştir. Ancak bazılarının performanslarının poloksamer 188’e göre kötü olduğu ve bazılarının da ticari olarak bir katma değer sağlamadığı görülmüştür. Poloksamer 188, memeli hücreleri için kültür ortamlarının önemli bileşenlerinden biri haline gelmiştir. Özellikle, terapötik proteinlerin ve monoklonal antikorların üretiminde sıklıkla tercih edilen hassas hamster yumurtalık (CHO) hücre hatları için daha da önemli bir bileşen olmuştur.
Proses ve hücre hatlarının geliştirilmesindeki son ilerlemeler, yüksek hücre yoğunluklarına ulaşılmasını ve ticari üretimlerde ürün titrelerinin 10-13 g/L seviyelerine kadar artırılmasını sağlamıştır[20]. Bu koşullar altında, kesme gerilim kuvvetlerinin azaltılması ve hücre topaklanmalarının engellenmesinde poloksamer 188’in önemli bir etkisi olmuştur. Böylece, yüksek oranda hücre canlılığı ve büyüme hızlarına ulaşılmıştır.
Son zamanlarda oral ilaç uygulamalarında kullanılan poloksamer 188 türünün performansındaki değişkenliklerin biyolojik ürünlerin ticari üretimlerinde hücre canlılığı ve ürün verimi üzerinde ters bir etkiye sahip olduğu bildirilmektedir. Bu nedenle, hücre kültürü için özel olarak geliştirilen ve tutarlı bir performansa sahip olan poloksamer 188’in kullanımı önem kazanmıştır ve bu performansı öngörebilecek birçok test metodu önerilmiştir.
Tharmalingam, T.[15] ve Murhammar, D.W.[16], performans, değerlendirmeleri için karıştırma işlemi ile kesme gerilimi meydana getirerek küçük ölçekli hücre kültürü deneylerinin[21] gerçekleştirilmesini önermişlerdir. Bu kapsamda, toplam canlı hücre sayısı veya belirlenen sonlanma noktalarından sonraki büyüme hızları esas alınarak poloksamer 188’in koruyucu etkisi belirlenmiştir. Bu test sistemlerinin farklı poloksamer 188 serileri arasındaki farklıkları tespit edebilme kapasitesine sahip olduğu ve elde edilen sonuçların da endüstri ölçeğindeki uygulamalar ile korelasyon gösterdiği tespit edilmiştir.
Hücre kültürü ve köpük stabilitesi[21] gibi diğer performans metotlarına ek olarak birçok kromatografik prosedürler, polimerin stabilitesi ve kompozisyonu ile ilgili bilgi sağlamak ve poloksamer 188 hammaddesinin hücre kültüründeki performans değişkenliğini tetikleyebilecek karakteristik özelliklerini göstermek amacıyla yayınlanmıştır. Bu kapsamda, lazer desorpsiyon iyonizasyonu veya nükleer manyetik rezonans ile birleştirilmiş boyut dışlama kromatografisi[22] ve kütle spektroskopisi[23] gibi farklı hassasiyetlere sahip sistemlerle birleştirilmiş ters faz sıvı kromatografisi metotları kullanılmaktadır. Poloksamer 188 hammaddesinde yer alabilecek çok küçük miktarlardaki hidrofobik ve yüksek molekül ağırlığına sahip türlerin kayma gerilimine karşı koruyucu etkinliğini azaltabileceği yönünde genel bir kanı oluşmuştur[21,24,25].
3. Yeni Kromatografik Yöntemler ile Safsızlıkların Tespiti
BASF, hücre kültürü performansı üzerine negatif etkisi olduğu düşünülen hidrofobik türlerin tayini için yeni bir yüksek performans sıvı kromatografisi metodundan faydalanmaktadır. Gradient polimer elüsyon kromatografisi (GPEC), korona dedektörü ile birlikte ters faz modunda çalıştırılarak diğer poloksamer 188 türleri için uygun bulunan limitin altındaki seviyelerde var olan hidrofobik türler tespit edilebilmektedir. İlk olarak polar çözücüyle gradient elüsyonu başlatılıp daha sonra polimerin çözünürlüğünü artırmak amacıyla apolar çözücüye geçirilerek ve apolar durağan faz kullanılarak ters faz modu (RP) ile ayırma işlemi gerçekleştirilmiştir. Bahsi geçen metot ile poloksamer 188 polimerindeki çok düşük seviyedeki hidrofobik türler tayin edilebilmektedir. Yeni RP-HPLC metodu ile BASF çok sayıda farklı Poloksamer 188 lotlarını analiz etmiştir. Şekil 2’de sunulduğu üzere hidrofobik türlerin varlığının lotlar arasında farklılık gösterdiği tespit edilmiştir.
4. Yeni Poloksamer Türünün Biyoteknoloji Uygulamalarında Kullanılması
Geliştirme çalışmaları sırasında edinilen tecrübeler doğrultusunda biyoteknoloji uygulamaları için BASF tarafından ticari adı Kolliphor P 188 Bio olan yüksek kalitede ve saflıkta yeni bir poloksamer 188 ürünü tasarlanmıştır. Kolliphor P 188 Bio üretiminde mikrobiyolojik testler, hücre kültürü testleri ve RP-HPLC analizi gibi ek kontrollerin ve valide edilmiş bir üretim prosesinin uygulanmasının biyofarmasötik üretim için bazı kalite gereksinimlerinin karşılanmasını sağlayabileceği düşünülmektedir. Şekil 3’te üç farklı lot Kolliphor P 188 Bio için RP-HPLC analiz sonuçları ve Şekil 4’te Kolliphor P 188 Bio’nun üç farklı lotu için hücre kültürü miktar tayini sonuçları gösterilmektedir. Yapılan analizler sonucunda üç lotta da hidrofobik pikler tespit edilememiştir ve hücre kültürü miktar tayini sonuçlarının da benzer olduğu görülmüştür.
Düşük oranlarda kullanılmasına rağmen poloksamer 188 hammaddesi biyoreaktörlerde meydana gelen kesme gerilimlerinden memeli hücrelerini koruyarak biyofarmasötik üretimlerde fayda sağlamaktadır. En son yayınlar, monograf metotlarıyla tespit edilemeyen çok düşük seviyelerdeki hidrofobik türlerin varlığına bağlı olarak Poloksamer 188’in değişken performanslar sergilediğini göstermiştir. Bu noktadan hareketle, Kolliphor P 188 Bio ürünü spesifik olarak biyoteknoloji uygulamaları için uygun kontroller tatbik edilerek tutarlı performansı sağlamak amacıyla tasarlanmıştır.
Referanslar [1] Guth, F., Staal, B and Jackson, T., Kolliphor P 188 Bio : A new era in shear protection, 2017, BASF SE, Germany. [2] European Pharmacopoeia, 8th Edition, 2013. [3] United States Pharmacopeia 39 – National Formulary 34, 2016.
[4] Japanese Pharmaceutical Excipients, 2012. [5] Reintjes, T., Solubility Enhancement with BASF Pharma Polymers, Solubilizer Compendium, 2011, BASF. https://industries.basf.com/images/global/corp/Pharmaceuticals1/b_03_110921e_solubility_enhance_compendium.pdf[6] Alexandridis, P. and Hatton, T.A., Poly (ethylene oxide)-poly (propylene oxide) block copolymer surfactants in aqueous solutions and at interfaces: Thermodynamics, structure, dynamics and modeling. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 1995, 96, 1-46. [7] Moloughney, J.G. and Weisleder, N., Poloxamer 188 (P188) as a membrane resealing reagent in biomedical applications, Recent Patents on Biotechnology, 2012, 6, 200-211. [8] Murhammer, D.W. et al., Sparged animal cell bioreactors: Mechanism of cell damage and Pluronic F-68 protection, Biotechnology Progress, 1990, 6, 391-397. [9] Wu, J., Mechanisms of animal cell damage associated with gas bubbles and cell protection by medium additives, Journal of Biotechnology, 1995, 43, 81-94. [10] Wu, J. et al., Effects of surface-active medium additives on insect cell surface hydrophobicity relating to cell protection against bubble damage, Enzyme and microbial Technology, 1997, 21, 341-348. [11] Chalmers, J. J. et al., Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: Current Opinion in Chemical Engineering, 2015, 10, 94-102. [12] Sieblist, C. et al., Influence of Pluronic F 68 on oxygen mass transfer, Biotechnology Progress, 2013, 29, 1278-1288. [13] Tharmalingam, T.et al., Pluronic enhances the robustness and reduces the cell attachment of mammalian cells, Molecular Biotechnology, 2008, 39, 167 -177. [14] Chisti, Y et al., Animal-cell damage in sparged bioreactors, TIBITECH, 2000, 18, 420 -432. [15] Tharmalingam, T. et al., Evaluating the impact of high Pluronic F 68 concentrations on antibody producing CHO cell lines, Biotechnology and Bioengineering, 2015, 112, 832 – 837.
[16] Murhammer, D.W. and Goochee, C.F., Structural features of nonionic polyglycol polymer molecules responsible for the protective effect in sparged animal cell bioreactors, Biotechnology Progress, 1990, 6, 142148. [17] Chattopadhyay, D. et al., The protective effect of specific medium additives with respect to bubble rupture, Biotechnology and Bioengineering,1995, 45, 473480. [18] Hu, W. et al., An investigation of small-molecule surfactants to potentially replace Pluronic F-68 for reducing bubble associated cell damage, Biotechnology and Bioengineering, 2008, 101, 119-127. [19] Wu, J. et al., Evaluating sugar-based detergents as a potential alternative to poloxamer bubble protectant, Cell Culture Engineering XV, May 2016. [20] Gronemeyer, P. et al., Trends in upstream and downstream process development for antibody manufacturing. Bioengineering, 2014, 1, 188-212. [21] Peng, H. et al., Mechanism investigation for poloxamer 188 raw material variation in cell culture, Biotechnology Progress, 2016, 32, 767-775. [22] Gallet, G., Thermal degradation of poly (ethylene oxide-propylene oxide-ethylene oxide) triblock copolymer: comparative study by SEC/NMR, SEC/MALDI-TOFMS and SPME/GC-MS, Polymer, 2002, 43. 1081-1094. [23] Hilton, M.D., Small-scale liquid fermentations, In: Demain, A.L. and Davies, J.E. (Editors): Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology 2nd Edition, American Society of Microbiology, Washington, 1999. [24] Charaniya, S. et al., Impact of poloxamer 188 variability on biologics manufacturing: Mitigations and causal investigation, CCE XV, May 2016. [25] Kent, P.K. et al., Cell culture performance and impurity levels in poloxamer 188, IBC Life Sciences, March 2014.
