Yeni Retinol Alternatifi

Yeni Retinol Alternatifi: Yeni Nesil Dizileme, Hidroksipinakolon Retinoat Etkinliğini Keşfediyor

Özet

Retinol, kırışıklık azaltma ve cilt yenilemede yüksek etkinliğe sahip yaşlanma karşıtı bir bileşendir. Retinol, yararlarının aksine, özellikle uzun süreli ve yüksek dozda kullanımda, iltihaplanma, spongioz, kızarıklık ve kuruluk gibi yan etkilere sebep olur. Geçmişte, pinakolon ester retinoidleri önerildi ve geliştirildi ancak bunların klasik retinol kullanımına göre mekanik ve etkili avantajları belirsizliğini koruyordu. Moleküler mekanizmalarını ve avantajlarını aydınlatmak ve karşılaştırmak için, pinakolon esterlerin iyi bilinen bir retinoid alternatifi olan hidroksipinakolon retinoat (HPR), yeni nesil dizileme ile bir bütün gen ifade analizinde ve bir in vivo kırışıklık önleme çalışmasında karşılaştırmalı olarak kullanıldı. Bu veriler, HPR’nin benzer bir gen alt kümesini aktive ettiğini, ancak aynı zamanda retinole kıyasla hücre dışı matris düzenlemesi, kornifiye zarf, keratinizasyon ve protein sindirimi ve absorpsiyonunda yer alan gen setleri üzerindeki gen ekspresyon etkinliğini geliştirdiğini ortaya koymaktadır. Yarım yüze uygulanan kırışıklık azaltmada in vivo etkinliği, retinolle tedavi edilen ciltte olduğu gibi önemli ölçüde ve aynı ölçüde artar, kusurları olmayan uygun bir retinol alternatifi olarak onaylanır.

Giriş

Retinoidler, beta-iyonen bazlı A vitamini türevi olarak tanımlanır. Beslenme yoluyla dahil edilirler, hayvansal kaynaklı Retinol ve Retinil esterleri veya bitki bazlı karotenoidler olarak bulunurlar. Retinoidler, dokuya ve aktif forma bağlı olarak çok sayıda işleve sahiptir. Spesifik olarak, farklı dokulardaki işlevleri, ilgili retinoid türevine ve retinoik asit stereoizomerlerine, örn. görme işlevselliği, retina hücrelerinde retinaya bağlanan rodopsin tarafından kolaylaştırılırken doku farklılaşması, örn. cilt epidermisi farklılaşması, ilgili dokudaki nükleer reseptörlerine bağlanan ve gen ekspresyonunu aktive eden retinoik asit (RA) stereoizomerleri tarafından düzenlenir. Burada 9-cis RA, esas olarak retinoid-X reseptörleri RXR’lerin ligandı olarak hareket ederken, Retinoik asit reseptörleri RAR, 9-cis RA ve all-trans RA(ATRA)’ yı bağlar ^1;2. Retinoidler hidrofobik olduklarından, sulu doku ortamına, görünümlerine göre plazma retinol bağlayıcı protein (RBP 4), interstisyel retinol bağlayıcı protein (RBP 3) ve hücresel retinol içinde bölünen retinoid bağlayıcı proteinler (CRP’ler veya RBP 1, RBP 2, RBP 5 ve RBP 7) tarafından taşınmaları gerekir. Bu taşıma proteinleri sadece retinoidlerin çözünmesini kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda onları oksidasyondan da korur. Ayrıca, hücresel retinoik asit bağlayıcı proteinler (CRABP), CRABP ko-aktivatör özelliklerine atıfta bulunan RXR ve RAR reseptörleri ile RA arasındaki etkileşime aracılık eder. RAR reseptörleri RA’ya bağlandığında bu, diğerlerinin yanı sıra RXR’ler, LXR’ler ve PPARγ gibi diğer reseptörlerle heterodimerizasyona izin veren konformasyonel değişiklikle sonuçlanır. RAR reseptörlerinin bu karışıklığı, RA’ların çeşitli dokulardaki pleiotropik etkilerine aracılık eder. Örneğin, heterodimer kompleks alt birimleri, bazal katmanda RARα/RXRα ve suprabazal katmanda RARγ/RXRα baskın olacak şekilde keratinositlerin farklılaşma durumu ile değiştirilir. RA, gen ekspresyonunu düzenleme fonksiyonunun yanı sıra, transkripsiyon faktörleri olarak oradaki aktiviteden farklı RAR ve RXR aktivasyonu yoluyla transkripsiyonel olmayan yol aktivitesi sergiler. Örneğin, RARα, RA’ya yanıt olarak lipid sallarında G proteinin alfa Q (Gαq) ile birleştirilmiş reseptör ile bir kompleks oluşturur ve p38 MAPK sinyali ³ aktive eder ve AKT’yi ve ardından ERK1/2’yi ⁴ aktive etmek için bağımlı olarak PI3K alt birimleri RA’yı bağlar. Yukarıda bahsedildiği gibi, retinoidler farklılaşma süreçlerini etkiler, özellikle keratin ve heparin bağlayıcı epidermal büyüme faktörü gen ekspresyonunun, böylece cilt farklılaşmasını ve bariyer fonksiyonunu düzenlediği keratinosit farklılaşması için gereklidirler. Açıkça suprabazal katmandaki KRT4 ve KRT1 3 upregüle edilir ve stratum spinozumda oluşan KRT2 downregüle edilir 5; 6. Ayrıca bazal keratinositlerin hücre bölünmesi artar, bu da hücre çoğalmasına ve ardından epidermal kalınlaşmaya neden olur ⁵. Bu sayede A vitamini eksikliği cilt problemlerine neden olabilir ve retinoidler keratinizasyon bozukluklarının tedavisinde kullanılır, örn. epidermolizis bülloza simpleks ve epidermolitik iktiyoz, aynı zamanda sedef hastalığı ve akne vulgaris tedavisinde de ⁶. Yaşlanma süreçlerinde keratinizasyon ve epidermal kalınlık bozulur. Burada retinoidler, topikal formülasyonlarda kırışıklıklar, pürüzlülük, gevşeklik, solgunluk, pullanma ve kuruluk dahil olmak üzere cilt fenotiplerini yavaşlatmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Özellikle, UV ile indüklenen fotoyaşlanmanın retinoidlerin kullanımıyla iyileştirildiği rapor edilmiştir ⁷. Mekanik olarak kırışıklıklar, gevşeklik ve pürüzlülük, dermalepidermal bağlantıları ve dermal doku elastikiyetini iyileştiren Kolajen I, III ve IV’ün düzenlenmesi yoluyla hafifletilir ^{8; 9}. Özetle, retinoidlerin yaşlanma fenotiplerinin yanı sıra sedef hastalığı ve akne vulgarisin topikal tedavisinde avantajlı etkiler sergiledikleri kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, son raporla, dikkatleri sınırlamalarına ve yan etkilerine odaklamaktadır. Retinoidlerin bir sınırlaması, retinoidler tarafından indüklenen CYP26 ailesi enzimleri ve diğer sitokrom P450 üyeleri tarafından artan inaktivasyonları ve bununla birlikte negatif bir geri besleme döngüsü ¹⁰ oluşturan RAR/RXR sinyalleri nedeniyle uzun süreli kullanımlarda azalan biyoyararlanımlarıdır. Bu etkiyle, istenmeyen cilt koşullarına yol açan bir A vitamini eksikliği meydana gelebilir. Diğer zararlı retinoid yan etkileri, retinoid kullanımının başlangıcında ortaya çıkan yanma hissi, kaşıntı ve eritem ile birlikte ‘retinoid reaksiyonu’ olarak karakterize edilir. Bu, tahriş reseptörü TRPV1’in retinoidler tarafından aktivasyonuna atfedilebilir ve kullanımlarına adapte olduktan sonra azalır ¹¹. Ancak, müşteriler ve hastalar ayrıca uzun süreli retinoid kullanımından sonra iltihaplanma, soyulma, kızarıklık ve ciltte kuruma gözlemlediler. Bu etkiyle, istenmeyen cilt sorunlarına yol açan A vitamini eksikliği meydana gelebilir. Diğer zararlı retinoid yan etkileri, retinoid kullanımının başlangıcında ortaya çıkan yanma hissi, kaşıntı ve eritem ile birlikte ‘retinoid reaksiyonu’ olarak karakterize edilir. Bu, tahriş reseptörü TRPV1’in retinoidler tarafından aktivasyonuna atfedilebilir ve kullanımlarına adapte olduktan sonra azalır ¹¹. Ancak, müşteriler ve hastalar ayrıca uzun süreli retinoid kullanımından sonra iltihaplanma, soyulma, kızarıklık ve ciltte kuruma gözlemlediler. Sonuç olarak, gözlenen tüm bu olumsuz etkiler çok yönlüdür ve moleküler nedenleri ayrıntılı olarak açıklığa kavuşturulmamıştır. Bu nedenle dermatologlar ve kozmetik endüstrileri, etkinliği iyi ancak yan etkileri azaltılmış retinoid alternatifleri geliştirme gerekliliğini düşündüler. Burada, Varani ve meslektaşları, daha az tahriş edici ve yan etkileri olan pinakolonik ester gibi retinoidler geliştirdiler ¹². Hidroksipinakolon retinoat (HPR), bunun piyasaya en iyi yayılan türeviydi. Ancak şimdiye kadar, all-trans retinol’e göre avantajlarını açıklamak için ayrıntılı bir mekanik karşılaştırma eksikti. Bu nedenle, bu çalışmada, stabilize edilmiş bir HPR karışımının (aşağıda “içerik” olarak bahsedilecektir) moleküler etkilerini aydınlatmak ve karşılaştırmak için tam bir transkriptomik dizileme (RNA-Seq), in vitro 3D yaklaşımı gerçekleştirdik. Ayrıca, bir in vivo çalışmada içeriğin kırışıklık azaltmada all-trans retinol ile aynı etkinliği sergilediğini gösterebiliriz.

Materyaller ve Metod

3D Yeniden Yapılandırılmış Epidermal Cilt Modellerinin Rna Dizilimi

EpiDerm yeniden oluşturulmuş 3D modeller (MatTek, Bratislava, Slovakya) 72 saat boyunca kültive edildi. Ardından araştırma ürünü SymRenewTM HPR 1 ve karşılaştırma yapılacak benchmark all-trans retinol, 5 gün boyunca günlük olarak uygulanır. Bu içerik, iyi bir stabiliteyi kolaylaştıran özel bir Hidroksipinakolon retinoate karışımıdır. Her deneysel koşul için, üç biyolojik kopya analiz edildi. Epiderm modelleri RNA lizis tamponunda toplandı. RNA Quiagen RNAeasy Mini kiti (Quiagen, Hilden, Almanya) kullanılarak izole edildi. Numuneler, Illumina TruSeq, zincirli, poli(A) ile zenginleştirilmiş RNA kütüphanesi hazırlığı için işlendi. Örnek başına sıralama, Illumina NextSeq, v2.5 ile 75 bp ve 30 Mio okuma gerçekleştirildi.

RNA Dizileme Veri Analizi

Illumina adaptör artıklarının çağrılması, çoğullamasının çözülmesi ve kırpılmasının ardından, veriler GRCh38 genomuna karşı eşlendi ve her bir gen için FPKM elde edildi. FPKM’nin ortalaması alındı ve işlenmemiş kontrole veya all-trans retinol ile işlenmiş numuneye göre normalleştirildi. Doğal logaritmik kat değişimi -1≤’den küçük ve ≥1’den büyük ve p-değeri <0.05 olan genlerin (FPKM <3 olan genler hariç tutulmuştur) önemli ölçüde diferansiyel olarak ifade edildiği kabul edildi. İşlevsel zenginleştirme ve kümeleme, DAVID Bioinformatics Resources 6.8 kullanılarak yapıldı. Bonferroni düzeltilmiş p değeri ≤ 0.05 olan fonksiyonel kümeler anlamlı kabul edildi.

In vivo Çalışma Kırışıklık Azaltma

Bu in vivo çalışma National Health Council for Regulatory Guidelines and Standards Kararı 466/12’nin tespitlerine göre gerçekleştirilmiştir. 96 araştırma deneğine (ortalama yaş: 55 ± 5 yıl, Fototip (Fitzpatrick) %3 fototip II ve %97 fototip III), çalışmaya başlamadan 48 saat önce yüzlerinde herhangi bir topical ürünü kullanmayı bırakmaları talimatı verildi. Ayrıca laboratuvarlarda test yapma ve çalışma süresi boyunca herhangi bir ürün kullanmamaları hakkında talimat aldılar. Çalışma, talimatlara göre araştırma ürünleriyle yapılan tedavinin yüz derisinin yaşlanma belirtilerini azaltabileceği hipotezine dayanıyordu. Bu çalışmada kullanılan metodoloji, görüntü analizi ile kırışıklıkların ve yüz ifade çizgilerinin azaltılmasını değerlendirir. Yüz görüntüleri başlangıçta, 14 ve 28 günlük ev içi kullanımdan sonra elde edildi. Araştırma denekleri, araştırma ürünlerini bir sabah ve bir akşam olmak üzere günde iki kez uygulamıştır. Araştırma deneklerine, bir araştırma ürününü yüzün sağ tarafına ve başka bir araştırma ürününü yüzün sol tarafına uygulama veya yüzün bir tarafını (sağ veya sol) kontrol şeklinde tutma talimatı verildi. Uygulama tarafı (sağ veya sol) denekler arasında rastgele dağıtıldı. Her bir araştırma deneğinin yüz morfolojisine, büyüklüğüne ve bulunduğu bölgeye göre kırışıklıkların ve mimik çizgilerinin bulunduğu bölge, analiz için belirlendi. Görüntüler, çalışmanın başlangıcında ve araştırma ürünlerinin evde kullanımından 14 ve 28 gün sonra, maksimum 50 mikrometrelik çözünürlükte Primos CR Large field (Canfield®) ekipmanı aracılığıyla elde edildi. Elde edilen görüntüler, VAM yazılımı, sürüm 5.9.7, Canfield Scientific Inc kullanılarak, belirlenen bölge üzerine paralel çizgiler eklenerek analiz edildi. İstatistiksel yöntem ANOVA - Dunnet testi ile , %95 güven aralığı dikkate alınarak yapıldı. Kırışıklıkların ve çizgilerin yoğunluğu, ISO4287 standardına göre analiz edilen profilin, daha derin vadisine atıfta bulunan pürüzlülük parametresi Rv %’nin değerleri kullanılarak belirlendi. ¹ SymRenewTM HPR, produced by Symrise (https://www.symrise.com/scent-and-care/cosmetic-ingredients/, Holzminden)

Sonuçlar

Kozmetikte yaygın olarak kullanılan retinolün, transkripsiyonel düzenlemelerini, yeni önerilen alternatif içeriğe kıyasla açıklamak ve karşılaştırmak için, 3D yeniden yapılandırılmış epidermis modellerinde bir RNA-Seq gerçekleştirildi. RNA Seq analizi, içeriğin işlenmemiş-untreated numuneye kıyasla 2747 genin, gen ekspresyonunu değiştirdiğini ortaya koymaktadır. Alltrans retinol, tedavi edilmemiş kontrole kıyasla 3893 genin ekspresyonunu değiştirir. Diferansiyel olarak düzenlenen bu genlerden 2254 gen, hem içerik hem de all-trans retinol tarafından düzenlenir (Şekil 1). Burada, her iki retinol türevi de seramid üretimi ve stratum corneum oluşumu yoluyla cilt bariyeri işlevini ve epidermal kalınlaşmayı destekleyen süreçler olan keratinizasyon, kornifiye zarf, keratinosit farklılaşması, peptit çapraz bağlanması ve sfingolipid biyosentezi ile ilişkili gen ekspresyonunu indükler (Şekil 2). Ayrıca, her ikisi de kemotaksis, ECM-reseptör etkileşimi, Golgi işlevi, hücrehücre bağlantı organizasyonu, protein salgılanması prosesleri ile bağlantılı gen ekspresyonunu inhibe eder. Bu düzenlemeler aynı zamanda artan bir keratinizasyona ve ardından burada baskılandığından gelişmiş bir stratum corneum oluşumuna işaret eder. Bu veriler, içerik tarafından indüklenen gen ekspresyonunun, all-trans retinol tarafından indüklenenden farklı olduğunu göstermektedir. İçeriğin all-trans retinole göre avanavantajlarını göstermek için, all-trans retinol tarafından değil, yalnızca içerik tarafından düzenlenen 493 geni analiz ettik (Şekil 3). Bunlar arasında, hücre dışı matris organizasyonununyukarı regülasyonu, hücre dışı matris ve kollajen ile ilişkili genler bulduk, bu da gelişmiş bazal membran oluşumunu ve dermal-epidermal ankrajını öne sürüyor. Ayrıca, cilt hücrelerini yaşlanma süreçlerinden korumak ve farklılaşma sırasında stratum corneum oluşumunu iyileştirmek için çok önemli olan protein sindirimi ve emilimi desteklendi. Bir sonraki adımda, içeriğin all-trans-retinol ile karşılaştırıldığında gen ekspresyonunu iyileştirip iyileştirmediğini inceledik. Bu nedenle, all-trans retinolün gen ekspresyon verileri, normalizasyon için kontrol olarak kullanıldı. Bununla, all-trans retinole kıyasla genleri diferansiyel olarak eksprese eden 843 gen bulduk (Şekil 4). Burada içeriğin, hücre dışı matrisin parçalanması, kollajen katabolik süreçleri ve interferon- gama sinyali ile ilişkili süreçleri downregule ettiğini göstermektedir. Bu, içeriğin hücre dışı matrisi ve kollajen bozulmasını baskıladığını ve all-trans retinolden daha az tahriş edici olduğunu gösterir. Öte yandan, diğerlerinin yanı sıra kornifiye zarf, peptid çapraz bağlanması, keratinosit farklılaşması ve hücre döngüsünde yer alan gen ekspresyonunu indükler. Ayrıca, kallikreinler, keratinler ve diğer keratinosit farklılaşmasıyla ilgili genlerin gen ekspresyonunu karşılaştırdık. Burada örneğin Keratin 1/10, Keratin 4/13, Filagrin (Şekil 5), gen ontolojisi verilerini destekleyen retinol ile muamele edilmiş numunelerdekinden daha yüksek bir oranda ifade edildi. Bu, içeriğin keratinosit farklılaşması açısından daha yüksek aktivite sergilediğini ve böylece all-trans retinole kıyasla eş-molar kullanıldığında epidermal kalınlaşmayı daha yüksek bir düzeye kadar iyileştirdiğini açıkça göstermektedir. İçeriğin all-trans retinole kıyasla, transkriptomik etkileri açıklandıktan sonra, fenotipik etkinliği bir in vivo kırışıklık çalışmasında değerlendirildi (Şekil 6). All-trans retinol formülasyonunun, 14 gün evde kullanımından sonra, kırışıklıkların yoğunluğunda %9.5’e varan %7.2’lik önemli bir azalma (P<0.05) oldu. Araştırmaya katılan deneklerin %100’ünde, kırışıklıklarda ve mimik çizgilerinde azalma olduğu gözlemlendi. İçerik için, kırışıklıkların yoğunluğunda %11,0’e ulaşan %8,5’lik önemli bir azalma (P<0,05) mevcuttu. Araştırmaya katılan deneklerin %94’ünde kırışıklıklarda ve mimik çizgilerinde azalma olduğunu gözlemlemek mümkün oldu. Araştırma ürününün 28 gün evde kullanımından sonra ise, plasebo kontrollü cilt ile karşılaştırıldığında, kırışıklıkların yoğunluğunda %12,6’lık önemli bir azalma (P<0,05) oldu ve %15,6’ya ulaştı. Araştırmaya katılan deneklerin %100’ünde kırışıklıklarda ve mimik çizgilerinde azalma olduğunu gözlemlemek mümkün oldu. İçerik için, plasebo kontrollü cilt ile karşılaştırıldığında kırışıklıkların yoğunluğunda %17,0’a ulaşan %13,4’lük önemli bir azalma (P<0,05) vardı. Araştırmaya katılan deneklerin %97’sinde kırışıklıklarda ve mimik çizgilerinde azalma olduğunu gözlemlemek mümkün oldu. Bu veriler, all-transretinol ve içerik için in vivo olarak kırışık azaltmada aynı etkinliği göstermektedir.

Tartışma ve Sonuç

Bu çalışma, all-trans retinol ile pinakolone esterlere dayalı alternatif bir türev olan içeriğin, moleküler ve fenotipik etkilerini karşılaştırmıştır. Burada, içeriğin all-trans-retinole kıyasla keratinosit farklılaşması ve bariyer oluşumu üzerinde gelişmiş transkriptomik aktivite gösterdiğini gösterebiliriz. Örneğin, içerik, bazal zarı güçlendirmek için hücre dışı matris organizasyonunu ve kollajen oluşumunu daha fazla artırdığından, all-trans retinole göre avantajlar sunar. İnterferon aracılı sinyali baskıladığı için daha az tahriş edicidir. Ayrıca, keratinosit farklılaşmasına ilişkin olarak daha fazla aktivite sergiler ve bu nedenle eş-molar konsantrasyonlarda kullanıldığında ve all-trans retinole kıyasla epidermal kalınlaşmayı daha fazla geliştirir. İn vivo kırışıklık çalışmasında, içerik ve all-trans-retinol, benzer etkinlikle önemli ölçüde kırışıklık azalmasına sebep olur. Bu çalışma ile, içeriğin, yaşlanma karşıtı kozmetik formülasyonlarda kullanımı için güvenli ve etkili bir alternatif içerik olduğu sonucuna vardık.   Kaynakça 1 Heyman, R A, Mangelsdorf, D J, Dyck, J Aet al (1992) 9-cis retinoic acid is a high affinity ligand for the retinoid X receptor. Cell 68(2) 397-406 2 Levin, A A, Sturzenbecker, L J, Kazmer, Set al (1992) 9-cis retinoic acid stereoisomer binds and activates the nuclear receptor RXR alpha. Nature 355(6358) 359-361 3 Piskunov, A, & Rochette-Egly, C (2012) A retinoic acid receptor RAR pool present in membrane lipid rafts forms complexes with G protein Q to activate p38MAPK. Oncogene 31(28) 3333-3345 4 Masiá, S, Alvarez, S, de Lera, A Ret al (2007) Rapid, Nongenomic Actions of Retinoic Acid on Phosphatidylinositol-3-Kinase Signaling Pathway Mediated by the Retinoic Acid Receptor. Molecular Endocrinology 21(10) 2391-2402 5 Szymański, Ł, Skopek, R, Palusińska, Met al (2020) Retinoic Acid and Its Derivatives in Skin. Cells 9(12) 2660 6 Törmä, H (2011) Regulation of keratin expression by retinoids. Dermato-endocrinology 3(3) 136-140 7 Hubbard, B A, Unger, J G, & Rohrich, R J (2014) Reversal of Skin Aging with Topical Retinoids. Plastic and reconstructive surgery 133(4) 8 Baumann, L (2007) Skin ageing and its treatment. J Pathol 211(2) 241-251 9 Puizina-Ivic, N, Miric, L, Carija, Aet al Modern approach to topical treatment of aging skin. Coll Antropol 34(3) 1145-1153 10 Isoherranen, N, & Zhong, G (2019) Biochemical and physiological importance of the CYP26 retinoic acid hydroxylases. Pharmacology & Therapeutics 204 107400 11 Yin, S, Luo, J, Qian, Aet al (2013) Retinoids activate the irritant receptor TRPV1 and produce sensory hypersensitivity. Journal of Clinical Investigation 123(9) 3941- 3951 12 Varani, J, Fay, K, & Perone, P (2007) MDI 301, a non-irritating retinoid, induces changes in human skin that underlie repair. Archives of Dermatological Research 298(9) 439-448   Yazarlar Maria Reichenbach, Symrise AG, Germany Michele Massironi, Cutech Srl, Italy Mickaël Larnicol, Symrise SAS, France                                                                                                                                                         Çeviren ve Derleyen                                                                                                                  Tuğba Bayazıt                                                                                                                        Teknik Aplikasyon Uzmanı Afrika, Orta Doğu, Türkiye Takım Lideri Symrise AG