Mekanik ve Spektroskopik Analiz
Biyosidal Ürün Katkılı Silgilerin Escherichia Coli ve Staphylococcus Aureus Bakterilerine Karşı Etkinliğinin İncelenmesi ve Spektroskopik Analizleri
1. Özet
Günümüzde antibakteriyel malzemelerin birçok uygulama alanları bulunmaktadır. Medikal aletler, diş dolguları, gıda sektörü gibi birçok farklı alanlarda mikroorganizmaların yok edilmesi ve yayılmasının önlenmesi için bu malzemelere ihtiyaç duyulmaktadır.
Özellikle gümüş (Ag), çinko (Zn), bakır (Cu), civa (Hg), titanyum (Ti) gibi ağır metal iyonlar yüksek antibakteriyel aktiviteye sahiptirler. Bu iyonlar bakteri enzimlerini etkisiz hale getirerek bakterilerin enzim reaksiyonlarını gerçekleştirmesini engeller ve yaşam ömürlerini kısaltırlar [1].
Tüketiciler tarafından antibakteriyel ürünler her zaman ilgi görmüş olsa da özellikle Covid 19 salgını sonrası daha da önemli hale gelmiştir. Bu çalışmada okullar, ofisler, evler gibi pek çok alanda özellikle elden ele taşınabilen ve bakteri yayma riski yüksek olan silgilerin üzerlerinde bakteri oluşumunu önlemesi amacıyla antibakteriyel özellik kazandırılması ve bunun yanında kimyasal açıdan herhangi bir risk teşkil etmemesi hedeflenmiştir.
2. Giriş
Bakteri ve mantar gibi mikroorganizmalar çıplak gözle görülmese de tüm ortamlarda yaşar ve aralarında patojen olan zararlı bakteriler de mevcut olabilir.
Bakterilerin üremesi, normal nem ve sıcaklık koşullarında bile gerçekleşebilir, plastikler de dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan nesnelerde kolayca yaşam alanı oluşturup, hijyen, sağlık ve estetik olarak olumsuz etkileri oluşturabilirler.
Üzerinde çoğaldıkları nesnelerde yüzey bozulmaları ve çatlamalar, renk bozulmaları, balçık oluşumları ve hoş olmayan kokular yaratabilirler. İlave olarak bulaşıcı hastalıklara sebebiyet verecek ortam ve koşullar yaratabilirler.
Antimikrobiyal bileşikler, çeşitli endüstriyel işlemlerde, içme suyunda, atık yönetiminde, günlük olarak kullanılan kozmetik ürünlerde, mobilyalarda ve bakteriyel ilaçlarda yaygın olarak kullanılmaktadır.
Antimikrobiyal bileşikler patojenik mikroorganizmaların büyümesini kontrol etmek veya cansız nesnelerden, yüzeylerden veya sağlam deriden uzaklaştırılması için yaygın olarak kullanılır [2].
Antimikrobiyal yüzeylere sahip ürünler oldukça arzu edilir. Bu yüzeyler tercihen hem Gram pozitif bakterilere (örneğin; Staphylococcus aureus) hem de Gram negatif bakterilere (örneğin; E. coli) karşı antibakteriyel bir etki sergiler [3].
Antimikrobiyal ürünler geniş koruma sağlar: bakteri, mantar ve virüslerin büyümesini engeller. Bu ürünler, çeşitli plastik eşyalara entegre edilerek özellikle eşya yüzeyinde antibakteriyel koruma özelliği sağlar.
Silgi, eğitim amaçlı uygulanan ve yaygın olarak kullanılan araçlardan (yazma, tasarlama, değiştirme) biridir. Silgi kullanımı sadece silme ile sınırlı değildir, vurgular, dokular oluşturmak ve hatta derin görsel efektler oluşturmak için uygulanabilir.
Kişiler (örneğin; öğrenci, öğretmen ve diğer profesyoneller olabilir) bu tür ürünlerle sıklıkla
temas halindedir. Bu nedenle içerikleri bazı kimyasal sınırlamalara tabiidir. Bu tür yaygın olarak kullanılan araçlarda antibakteriyel özellik bulunması, insanlarda, özellikle hassas sağlık durumları bulunan kişilerde kritik bir rol oynamaktadır.
Adel firması olarak, ‘Sağlık Bakanlığı Biyosidal Envanter Kaydı Yapılan Ürünler’ listesinde yer
alan Avient masterbatch ile antimikrobiyal teknolojisini kullanarak yeni geliştirdiğimiz silgilerimize antibakteriyel işlevsellik kazandırdık.
3. Materyal ve Metot
3.1. Antibakteriyel Testin Yapılışı
3.1.1. Test İnokulumunun Hazırlanması:
PCA’da 16-24 saat inkübe edilmiş kültürden steril öze ile 1/500 NB içerisine yoğunluğu 6x108 kob/ml olacak şekilde ayarlanır. Bakterinin tamamen dağıldığından emin olunur.
Bakteri konsantrasyonunu ayarlayabilmek için 1/500 NB ile tekrar seyreltilir. Bakteri konsantrasyonu 2.5x105 ile 10x105 kob/ml arasında olmalıdır. Hazırlanan bu süspansiyon test inokulümünde kullanılır.
3.1.2. Numunelerin Hazırlanması
6 adet işlem görmemiş ve 3 adet işlem görmüş test numunesi kullanılır. İşlem görmüş ya da görmemiş test örnekleri 50x50 mm ±2 düz olarak kesilir. Örnekler 10 mm’den kalın olmamalıdır. Yüzey alanı 400 mm2 ile 1600 mm2 arasında olmalıdır. Her bir numune için
40×40 mm’lik steril film kesilir.
Numuneler hazırlanırken mikroorganizmaların kontaminasyonundan ve organik döküntülerden uzak olunmalıdır. %70’lik etanol kullanılarak yüzey temizliği yapılır.
3.1.3. Numunelerin İnoküle Edilmesi
3 adet işlem görmüş ve 6 adet işlem görmemiş numuneler ayrı ayrı steril petri içerisine yerleştirilir. Test edilecek yüzey üst tarafta olmalıdır. Hazırlanan test inokülümünden
0,4 ml her bir numunenin üzerine pipetlenir.
İnokülümün üzerine steril film 40mmx40mm yerleştirilir ve yavaşça bastırılır. Örnek film ile kaplandıktan sonra petri kapağı kapatılır.
3 adet işlem görmüş ve 3 adet işlem görmemiş numune inkübatöre kaldırılır (Bu numuneler 24 saatlik temas anı olarak kabul edilir).
35±1ºC’de 24±1 saat inkübe edilir. İnkübatörde bağıl nem %90’dan az olmamalıdır. Diğer 3 adet işlem görmemiş numune ise 0 saat temas anı olarak kabul edilir.
İnokülasyondan hemen sonra yıkama işlemi uygulanır. Numune steril film ile kaplandıktan sonra inokülüm üzerinde hava kabarcığı veya hava olmamalıdır.
3.1.4. Test Numunesinden Bakterinin Geri Kazanımı
İnokülasyondan Hemen Sonra
İnokulumdan hemen sonra geri kalan 3 adet işlem görmemiş numune üzerine doğrudan 10 ml SCDLP çözeltisi (Lesitin ve polioksietilen sorbitan monooleat içeren soya fasülyesi kazein çözeltisi) ilave edilir ve petrinin kapağı kapatılarak yavaşça karıştırılır.
Numunenin tamamen nötralizasyon çözeltisi ile ıslanması sağlanır. Pipet yardımıyla en
az 4 defa çözelti petriden alınır ve tekrar numune üzerine pipetlenir. Numunenin şekline ve boyutuna göre 10 ml den az kullanılması gerekiyorsa, kullanılan hacim raporda kayıt edilir.
3.1.5. Dökme Plak Yöntemi ile Bakteri Sayılarının Bulunması Yöntemi
Yıkama işleminden sonra süspansiyondan 1 ml alınır ve 9 ml fosfat buffer (1/10 seyreltme) içerisine pipetlenir. Hazırlanan bu çözeltiden tekrar 1 ml alınır ve 9 ml fosfat buffer içerisine pipetlenir.
Bu şekilde 1/100 seyreltilmiş çözelti hazırlanır. Her bir seyreltmeden 2 ayrı petriye olmak üzere 1’er ml konur. 46-48 ºC’ye soğutulmuş PCA’dan (Plate count agar) 15-20 ml bakteri süspansiyonu üzerine dökülür.
Yavaşça karıştırılır ve oda sıcaklığında soğuması beklenir. Agar katılaştıktan sonra 35±1°C’de 40-48 saat inkübe edilir. İnkübasyon sonrasında seri olarak seyreltme yapılmış
petrilerdeki üreyen bakteriler sayılır.
30 ile 300 arasında koloni gözlemlenir. Üreyen koloni sayısı <30 ise, 1ml daha bu çözeltiden agar üzerine ekim yapılır. Şayet agar üzerinde hiç üreme yok ise <1 olarak raporlanır.
3.1.6. Bakteri Sayısının Bulunması
Her bir numune için aşağıdaki formül kullanılarak üreyen bakteri sayısı hesaplanır.
N= (100×C×D×V) / A
N : Bakteri sayısı
C : Çift petrideki ortalama koloni sayısı
D : Dilüsyon faktörü
V : Kullanılan SCDLP çözelti hacmi (ml)
A : Filmin yüzey alanı (mm²)
Agar üzerinde hiç bakteri kolonisi ürememiş ise numuye eklenen SCDLP çözelti hacmi kadar <V yazılır. V= 10ml SCDLP ise sonuç <10 yazılır.
3.1.7. Testin geçerliliğinin kontrol edilmesi
Yapılan testin geçerli olabilmesi için aşağıda verilen 3 şartında yerine getirilmiş olması gerekir.
a) (Lmax - Lmin) / (Lmean) ≤ 0,2 inokülasyondan sonra işlem görmemiş numunedeki bakteri sayılarının log değerleri alınır.
b) İnokulasyondan hemen sonra işlem görmemiş numunedeki bakteri sayısının ortalaması 6,2x103 cells/cm2 ile 2,5x104 cells/cm2 olmalıdır.
c) İşlem görmemiş numunelerin 24 saatlik inkübasyonundan sonra elde edilen bakteri sayısı 6,2x101 cells/cm2’den küçük olmamalıdır [4].
Lmax: İşlem görmemiş numunenin paralelleri üzerinde bulunan maksimum kob sayısının logaritması
Lmin: İşlem görmemiş numunenin paralelleri üzerinde bulunan minimum kob sayısının logaritması
Lmean: İşlem görmemiş numunenin paralellerinin kob sayısı ortalamasının logaritması
3.1.8. Antibakteriyel Aktivitenin Hesaplanması
R= (Ut – U0) – (At – U0) = Ut – At
R: Antibakteriyel aktivite
U0: İşlem görmemiş numunenin inokülasyondan hemen sonraki logaritmik değeri
Ut: İşlem görmemiş numunenin 24 saat inkübasyondan hemen sonraki logaritmik değeri
At: İşlem görmüş numunenin 24 saat inkübasyondan sonraki logaritmik değeri
Sonuçların etkili olarak kabul edilmesi için R ≥ 2 olmalıdır [5].
3.2. Silgilerin Fiziksel ve Spektroskopik Karakterizasyonları
3.2.1. Mekanik Özellikler
Antibakteriyel ajan içerikli ve antibakteriyel ajan içermeyen test numunelerinin yoğunluk, sertlik, kopma anındaki gerilme dayanımı, kopma anındaki uzama, %100’deki modülüs değerlerine bakılmıştır.
Yoğunluk değeri ASTM D792, sertlik değeri ASTM D2240, diğer mekanik değerler ise ASTM D412 standartlarına göre yapılmıştır.
3.2.2. Spektroskopik Yöntemler ile Kimyasal Analizler
3.2.2.1. Poliaromatik Hidrokarbonların (PAH) Tayini
500 mg silgi numunesi üzerine 20 ml Toluen ve internal standart karışımı eklenerek 600C’lik ultrasonik banyoda 1 saat süre ile ekstrakte edilir.
1 saat sonunda oda sıcaklığına soğutulan çözeltiten 1 ml vial içerisine alınarak GC-MS
cihazında AfPS GS 2019:01 PAH metodu ile Poliaromatik Hidrokarbonların tayini yapıldı [6].
3.2.2.2. Fitalatların Tayini
50 mg silgi numunesi üzerine 5 ml Tetrahidrofuran (THF) çözeltisi eklenerek çözünmesi için çalkalayıcılı karıştırıcıda 30 dakika süre ile bekletildi.
30 dakika sonunda her 5 ml THF’e karşı 10 ml Asetonitril ya da Hekzan eklendi ve 5 dakika süre ile çalkalandı. Çalkalama bittikten sonra çözelti 45 μm’lik membran filtreden süzülerek viale alındı ve GC-MS cihazında CPSCCH- C1001-09.4 metodu ile fitalatların tayini yapıldı [7].
3.2.2.3. Kadmiyum Tayini
0,5 gram silgi numunesi Kijeldal tüpüne tartıldı. Tüp ısıtıcı üzerine yerleştirilerek içerisine 10 ml sülfürik asit eklendi ve organik bileşiklerin uzaklaştırılması için yüksek sıcaklığa kadar ısıtıldı, beyaz duman oluşumundan sonra 15 dakika daha ısıtılmaya devam edildi ve sonra tüp ısıtıcıdan alınarak 10 dakika soğutuldu.
Bir huni yardımıyla tüpün içerisine 5 ml hidrojen peroksit çözeltisi yavaşça eklendi ve yüksek sıcaklığa kadar ısıtıldı ardından oda sıcaklığına soğutulup tekrardan 5 ml hidrojen peroksit eklendi ve yeniden yüksek sıcaklığa kadar ısıtıldı.
Bu hidrojen peroksit ekleme işlemi 4 defa 5 ml eklenecek şekilde yapıldı. Oda sıcaklığına
soğutulan çözelti 100 ml’lik balon jojeye alındı ve destile su ile tamamlandı. Çözelti içerisinden 1 ml örnek membran filtre ile viale alınarak ICP-MS cihazında BS EN 1122:2001 metodu ile Kadmiyum tayini yapıldı [8].
3.2.2.4. Kurşun Tayini
150 mg silgi numunesi mikrodalga tüpüne tartıldı. Tüpün üzerine oda sıcaklığında 5 ml konsantre nitrik asit eklendi. Tüpün ağzı kapatılarak mikrodalga cihazında 200ºC’de 20 dakika bekletildi. Numune mikrodalgadan çıkarılmadan önce 5 dakika soğumaya bırakıldı.
Mikrodalga kabı çeker ocak altında açıldı ve içerisindeki çözelti 50 ml’lik balon jojeye alındı ve destile su ile 50 ml’ye tamamlandı. 50 ml’ye tamamlanan çözeltiden 1 ml viale alınarak ICP-MS cihazında CPSC-CH-E1002 metodu ile Kurşun tayini yapıldı [9].
4. Bulgular
Yapılan çalışmalar sonucunda, ISO 22196:2011 standardı ile test edilen antimikrobiyel katkı içerikli silgi örneğinin E.Coli ve S.Aureus mikroorganizmalarına karşı Antibakteriyel Aktivite (R) değeri 2’den büyük, %Antibakteriyel Aktivite değeri ise %99.99 bulunmuştur.
Ürünümüzün E. Coli ve S. Aureus gibi insan için zararlı olan enfekte edici bakterilere karşı antibakteriyel aktiviteleri kanıtlanmıştır. Yapılan antibakteriyellik testinde şu sonuçlar elde edilmiştir.
Ürün kalitesini sağlamak için mekanik özellik gibi standart karakteristiklerin kontrolü malzeme endüstrisinde önemlidir.
Bu sebeple bir katkı ajanı, polimerik bileşimin orjinal karakterini bozmadan performansının gelişmesine olanak tanımalıdır [5]. Antibakteriyel ajan içermeyen standart silgi ile antibakteriyel ajan içerikli silgilere ait mekanik test sonuçları aşağıdaki tablodaki gibi bulunmuştur.
Tablo 3’te antibakteriyel ajan katkılı ve katkısız standart silgi numunelerine ait mekanik test sonuçları verilmiştir.
Verilere göre her iki numunenin yoğunluk değerleri aynı olduğu gözlenmiştir.
Kopma anındaki gerilme ve %100’deki elastik modülüs değerleri birbirine oldukça yakın iken, antibakteriyel ajanın 4 birim civarında bitmiş ürün sertliğini arttırdığı gözlenmiştir. Sertliğin artması ile beraber antibakteriyel ajan içerikli malzemenin uzama değerinde düşüş gözlenmiştir.
Sertlik değerindeki bu artış ve kopma anındaki uzamada görülen düşüş, standart silgi numunesinin istenen limit değerleri içerisindedir.
Silgi numunesinin spektroskopik analizleri sonucunda; fitalat türlerinin GC-MS cihazı ile kontrolü yapılmış ve aşağıdaki (Tablo 4) Fitalat türlerinin hiçbiri tespit edilmemiştir. Türkiye
KKDİK (Kimyasalların Kaydı, Değerlendirilmesi, İzni ve Kısıtlanması) yönetmeliğine göre plastik materyal içinde ağırlıkça %0,1’den daha yüksek konsantrasyonlarda bu fitalatların kullanılması yasaktır [10].
Silgimizin analizi sonucunda ilgili yönetmelik değerlerine uygun olduğu görülmüştür. Silgi numunesinin PAH türlerinin GC-MS cihazı ile kontrolü yapılmış ve aşağıdaki (Tablo 5) PAH türlerinin hiçbiri tespit edilmemiştir.
Türkiye KKDİK yönetmeliğine göre aşağıdaki PAH türlerinden bazıları(*) insan cildi ile uzun süreli temas edebilecek olan plastik veya kauçuk malzemelerde 0,5 mg/kg’dan daha büyük miktarlarda bulunamaz [10].
Silgimizin analizi sonucunda ilgili yönetmelik değerlerine uygun olduğu görülmüştür. Silgi numunesinin Kurşun ve Kadmiyum içeriğinin ICP-MS cihazı ile kontrolü yapılmış, Kurşun (Tablo 6) ve Kadmiyum (Tablo 7) bileşikleri tespit edilmemiştir.
KKDIK yönetmeliğine göre; Kurşun konsantrasyonu eşyalarda ve eşya parçaların normal ve öngörülen kullanımlarında ağırlıkça %0,05’e eşit veya daha yüksek ise halkın kullanımına sunulan ve çocukların ağızlarına alabilecekleri eşyalarda kullanılmaz ve piyasaya arz edilemez.
Plastik materyallerden üretilen karışımlar ve eşyalar plastik materyalin ağırlıkça %0,01’ine eşit veya büyük konsantrasyonda kadmiyum içeriyorlarsa piyasaya arz edilemezler diye belirtilmiştir [10].
Silgimizin analizleri sonucunda Kurşun ve Kadmiyum değerlerinin ilgili yönetmelik limit değerlerine uygun olduğu görülmüştür.
5. Sonuçlar ve Yorumlar
Bu çalışmamızda silgi üretimimizde termoplastik elastomer içerikli polimer ve Avient antimiktobiyel çözümü ile ilerledik.
Antimikrobiyel aktifler, polimer matrisi içinde hareket eder ve malzemelerin yüzeyine yayılarak antimikrobiyal etkinlikte bir koruma kalkanı sağlar.
Organik antimikrobiyaller düşük konsantrasyonlarda etkilidir ve 250°C’yi aşmayan sıcaklıklarda işlenen polimerlerde uygun bir maliyet/performans oranı sunar.
Antibakteriyel etki testleri yukarıdaki tablolarda (Tablo 1 ve 2) verilmiştir. Test edilen örneklerde ISO 22196:2011 standartlarına göre 24 saat sonunda Escherichia coli ve Staphylococcus aureus bakterilerinin sırasıyla 5.63 ve 4.35 log azaldığı görülmüştür.
Bu da antibakteriyel aktivite R’nin 2’den büyük olduğu ve yüzdesel olarak 99.99 olduğunu göstermektedir. Yüksek antibakteriyel aktivite gösteren bu silgiler tüketicinin uzun süre güvenle kullanabileceği bir ürün haline gelmiştir.
Yapılan çalışmaya göre sertlik değeri 61 Shore A olan silginin antibakteriyel ajan ilavesi ile 65 Shore A değerine yükselmiştir. Standartlar içerisinde olan bu değer kullanıma uygundur.
Tüm yapılan antibakteriyel, fiziksel ve kimyasal testler sonucunda silgimizin çalışılan standartlarda ve yönetmeliklerde verilen limit değerlere uygun olduğu bunlara ilave olarak antibakteritel etki değerine sahip olduğu görülmüştür.
6. Referanslar
[1] Oz, Elif. Foto-“Click” Tepkimesiyle Hazırlanan Gümüş Nanopartikül İçeren Termoset Polimerlerin Endüstriyel Uygulamaları. Yüksek Lisans Tezi, Yalova Üniversitesi, 2016.
[2] US 10,314,312 B2, Vineet Sharma, Ashutosh Agarwal, ‘Synergistic antimicrobial composition of zinc pyrithione’, 2018-10-31, assigned to Jubilant Life Sciences Ltd
[3] US 2012/0276040 A1, Vincent T. Chuang, ‘Antimicrobial compositions and methods of making same’, 2012-11-01
[4] ISO 22196:2011 Measurement Of Antibacterial Activity On Plastics And Other Non-Porous Surfaces
[5] Michele Pittola *, Daiane Tomacheskia,b, Douglas Naue Simõesa,b, Vanda Ferreira Ribeiroa,b, Ruth Marlene Campomanes Santanab (2017) ‘Antimicrobial Performance of Thermoplastic Elastomers Containing Zinc Pyrithione and Silver Nanoparticles.
[6] Product Safety Commission (AfPS) GS Specification Testing and assessment of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) AfPS GS 2019:01 PAK
[7] CPSC-CH-C1001-09.4 Standard Operating Procedure for Determination of Phthalates January 17, 2018.
[8] BS EN 1122:2001 Plastics - Determination of Cadmium - Wet Decomposition Method
[9] Test Method: CPSC-CH-E1002-08.3 Standard Operating Procedure for Determining Total Lead (Pb) in Nonmetal Children’s Products.
[10] Çevre ve Şehircilik Bakanlığının 30105 Sayılı Kimyasalların Kaydı, Değerlendirilmesi, İzni ve Kısıtlanması Hakkında Yönetmelik
Elif Öz Çetin
Ar-Ge Uzmanı
Yüksek Kimya Mühendisi
Adel Kalemcilik Ticaret ve Sanayi A.Ş.
Dr. Fatma Seda Güreli Feridun
Ürün Güvenliği ve Regülasyon Uzmanı
Dr. Kimyager
Adel Kalemcilik Ticaret ve Sanayi A.Ş.
