İlaç Endüstrisi- Manuel Titrasyon Prosedürlerinizi Otomatik Titrasyona Dönüştürmek için Tavsiye ve İpuçları

İlaç Endüstrisi- Manuel Titrasyon Prosedürlerinizi Otomatik Titrasyona Dönüştürmek için Tavsiye ve İpuçları Tamamlayıcı farmakope monograflarında yer alan çeşitli titrimetrik assay metotlarının zaman içinde kromatografik metotlar ve diğer nicel tekniklere dönüştürülmüş olmasına rağmen titrasyon, farmasötik analitik prosedürler ve ilgili süreçler çerçevesinde hala oldukça önemli bir konuma sahiptir. Karbonat/bikarbonat veya monobazik ve dibazik fosfat tuzları arasındaki ayrımlar gibi uygulamalar sadece titrasyon yöntemi ile gerçekleştirilebilmekte ve bu durum söz konusu tekniğin amaca yönelik bir metot olarak gerçek önemini ortaya koymaktadır. Örneğin, Karl Fischer (KF) titrasyonu ile nem tayini yüksek seviyede suya selektif olup mg/L (ppm) seviyelerine ulaşabilecek kadar hassas bir uygulama tekniği olarak göze çarpmaktadır. Halihazırda ilaç endüstrisinde seçici ve güvenilir su içeriği analizleri için modern KF titrasyon enstrümanları kullanılıyor olmasına rağmen birçok USP monografı diğer uygulamalar için hala manuel görsel dönüm noktası titrasyonu metotlarına atıfta bulunmaktadır. Renkli indikatörler yardımı ile görsel tespit, bir titrasyonun ekivalens noktasını belirlemenin en eski yöntemi olup, günümüzde sıklıkla kullanılmakta ve birçok farklı yönerge dahilinde önerilmeye devam etmektedir. Düşük maliyet ve az sayıda laboratuvar malzemesine ihtiyaç duymak ile birlikte, bu teknik renk değişimi stabil olana kadar manuel bir büret ile damla damla titrant ekleyerek dönüm noktasının belirlenmesi prensibine dayanmakta ve bu çerçevede zaman alıcı olabilmektedir. Görsel tespit ile gerçekleştirilen manuel titrasyon analizlerinin bir başka dezavantajı, bireysel operatörlerin renk algılarının farklılık göstermesi ve aynı zamanda aydınlatma koşullarına da bağlı olmasıdır. Bu duruma ek olarak, özellikle koyu renkli ve/veya bulanık çözeltilerde dönüm noktasının belirlenmesi oldukça zorlayıcı hale gelebilmektedir. Tüm bu etkenler, insan kaynaklı hatalara yatkınlığın artması ile birlikte sonuçların güvenilirliğinin de azalması anlamına gelmektedir. Bir başka büyük dezavantaj ise, görsel metodun otomasyona sokulabilmesinin mümkün olmaması ve bu nedenle doğrulanmasının zor ve veri bütünlüğünden yoksun olmasıdır. Bu inceleme yazımızda, mevcut bir manuel titrasyon prosedürünün yarı-otomatik veya tam otomatik bir titrasyon prosedürüne dönüştürülmesi ile ilgili adımlar hakkında ayrıntılı bilgiler sunmayı hedefliyoruz. Doğru elektrot ve titrasyon modu seçimi gibi konuların yanısıra, içeriği daha da anlaşılır kılmak için üç farklı örnek titrimetrik analize yakından bakıyor olacağız.

Seçilmiş Örnek Titrasyonlar

Mevcut manuel titrasyon prosedürü ile uygun yarı-otomatik veya otomatik titrasyon prosedürü arasındaki olası değişiklikleri göstermek için üç farklı analiz örneği seçilmiştir. Bunlar sırası ile:

1. Potasyum Sitrat: Potasyum sitrat assay testi, titrant olarak glasiyel asetik asit içerisinde perklorik asit ve indikatör olarak da kristal viyole kullanılan bir susuz ortam asit-baz titrasyonu yardımı ile gerçekleştirilmektedir.[1]
2. Kalsiyum Hidroksit: Kalsiyum hidroksit assay testi, titrant olarak disodyum EDTA (Na₂EDTA) ve indikatör olarak da hidroksinaftol mavisi kullanılan bir kompleksometrik titrasyon yardımı ile gerçekleştirilmektedir. [2]
3. Potasyum Bromür: Potasyum bromür klor limiti testi, titrant olarak gümüş nitrat, geri titrant olarak amonyum tiyosiyanat ve indikatör olarak da amonyum demir (III) sülfat kullanılan bir parçasal çöktürme titrasyonu yardımı ile gerçekleştirilmektedir. [3]

Yukarıda yer alan bu örnekler farklı titrasyon reaksiyonlarını ve analiz türlerini kapsayacak şekilde özel olarak seçilmiştir (ör. assay testleri veya safsızlıklar). Hangi Elektrot Kullanılmalı? Manuel bir titrasyonun yarı-otomatik veya tam otomatik bir prosedüre dönüştürülmesinde ilk ve en kritik adım, ekivalens noktasını tespit edecek olan uygun elektrodun seçimidir. Görsel dönüm noktası tespiti yerine bir sensör kullanılması, subjektif görsel insan algısı yerine objektif bir tespit aracı yerleştirilmesi anlamına gelmektedir. Böylece söz konusu analizin kolaylıkla otomatikleştirebilmesi ve doğrulanabilmesi mümkün hale gelmektedir. Elektrot seçimi, titrasyon türüne, numune matrisine ve titranta bağlıdır. Asit-baz titrasyonları, redoks veya çöktürme titrasyonlarından farklı elektrot türlerinin kullanımını gerektirmektedir. Bu duruma ek olarak, numune matrisinin de elektrot üzerinde farklı etkileri olabilmektedir. Örneğin, susuz ortam asit-baz titrasyonları ile sulu ortam asit-baz titrasyonlarında kullanılan kombine pH elektrotları farklılık göstermektedir. Tablo 1, titrant ve halihazırda kullanılan indikatöre bağlı olarak önerilen ilgili elektrotları listelemektedir. Bu tablo referans olarak alındığında, yukarıda seçilen üç örnek analiz için aşağıdaki elektrotlar seçilmiştir:

1. Potasyum sitrat assay testinde titrant olarak perklorik asit kullanılmaktadır [1]. Bu titrant için, indikatörden bağımsız olarak, susuz ortam titrasyonlarına uygun kombine bir pH elektrodu önerilmektedir.
2. Kalsiyum hidroksit assay testinde, titrant olarak disodyum EDTA kullanılmaktadır. Bu titrant için indikatöre bağlı olarak iki çeşit elektrot önerilmektedir. Kalsiyum hidroksit için hidroksinaftol mavisi indikatörü kullanılmakta [2] ve bu çerçevede yarı-otomatik veya otomatik titrasyon yönteminde kullanım için bir kombine kalsiyum elektrot önerilmektedir.
3. Potasyum bromürün klor limiti testi, geri titrant olarak amonyum tiyosiyanat kullanmaktadır [3]. Genellikle bu titrasyon için indikatör olarak sadece demir (III) amonyum sülfat kullanılmaktadır. Ancak elektrot seçimi direkt olarak örneğin kendisinden de etkilenebilmektedir. Seçilen bu uygulamada gümüş nitrat ile parçasal bir çöktürme titrasyonu gerçekleştirilmekte [3] ve bu çerçevede kombine bir gümüş elektrot tercih edilmektedir.

Metot Dönüşümü için Gerekli Diğer Ayarlamalar

Seyreltme Hacmi

Elektrot seçiminin tamamlanması ile birlikte, yarı-otomatik veya otomatik titrasyona geçişin en hayati adımı tamamlanmış olmaktadır. Öte yandan, hala bir takım ek ayarlamalara ihtiyaç duyulabilmektedir. Göz önünde bulundurulması gereken noktalardan biri titrasyonda kullanılacak olan seyreltici (su veya solvent) miktarıdır. Doğru sonuçların elde edilebilmesi için elektrodun hem ölçüm hem de referans alanlarının çözeltiye uygun seviyede daldırılmış olası gerekmektedir. Şekil 1’de bir kombine pH elektrodu için optimum daldırma derinliğini gösteren örnek bir görsel sunulmaktadır. Elektrot üreticileri, genellikle doğru ölçümler için gereken minimum daldırma derinliğini belirtmektedirler.

Üç Örnek Analize Baktığımızda:

1. Potasyum sitrat için, 25 mL glasiyel asetik asit solvent olarak kullanılmakta ve beher boyutu belirtilmemektedir [1]. Eğer 100 mL’lik bir beher kullanılırsa, 25 mL glasiyel asetik asit elektrodun dalma seviyesi için yeterli olmayacaktır. Bu nedenle solvent hacminin, örn. 50 mL’ye çıkarılması önerilmekte ve elbette aynı artışın kör analizinde de yapılması tavsiye edilmektedir.
2. Kalsiyum hidroksit için titrasyon başlangıcı öncesinde beher içinde toplam 165 mL hacim bulmakta ve yine herhangi bir beher boyutu belirtilmemektedir [2]. Eğer 250 mL hacimli bir uzun beher kullanılırsa, hacmin elektrodun dalması için yeterli olması nedeniyle seyreltici hacminin ayarlanmasına gerek duyulmayacaktır.
3. Potasyum bromür için, klor limiti testinde numune ön hazırlığından sonra erlen içerisinde 56 mL çözelti bulunmaktadır [3]. Titrasyon esnasında elektrodun rahatça dalması için geniş ağızlı bir erlene ihtiyaç duyulacaktır. Eğer 100 mL hacimli geniş ağızlı bir erlen kullanılırsa, elektrot yeterince derine dalamayacaktır. Bu nedenle titrasyonda kullanılan su miktarının artırılması (örn. 75 mL) gerekli olacaktır.

Yukarıdaki örneklerde görüldüğü üzere, titrasyon için kullanılacak kabın seçimi ihtiyaç duyulacak olan seyreltici miktarının belirlenmesinde önemli bir role sahiptir. Titrasyon kabının seçimi, aynı zamanda, titrasyon sırasında eklenen titrant miktarından da etkilenmektedir. Bu çerçevede, manuel bir titrasyonu yarı-otomatik veya otomatik bir titrasyona dönüştürürken değerlendirilmesi gereken bir başka önemli nokta olan numune miktarı karşımıza çıkmaktadır.

Numune Miktarı

Otomatik veya yarı-otomatik titratörler tipik olarak 10 mL veya 20 mL hacimli büretler ile donatılmışlardır. Bununla birlikte, birçok manuel titrasyon yönteminin 30 mL ve hatta 40 mL’nin üzerinde gelen dönüm noktaları bulunmaktadır. Titrasyon esnasında büretin yeniden doldurulması sistematik bir hataya yol açacağından, numune miktarının azaltılması bir gereksinim olarak ortaya çıkmaktadır. Numune miktarının azaltılması, titrasyon esnasında daha az titrant tüketilmesi ve bu çerçevede daha az atık oluşması avantajını da beraberinde getirecektir. Genel olarak bir titrasyonun ekivalens noktasının toplam büret hacminin %10’u ile %90’ı arasında yer alması önerilmektedir. Optimum bir numune miktarı alındığında tipik olarak toplam büret hacminin yarısı kadar bir titrant sarfiyatına yol açması hedeflenmektedir. Yarı-otomatik veya otomatik titrasyon için 20 mL’lik bir büret kullanıldığında optimum titrant tüketimi 10 mL civarında beklenebilir. Yine, yukarıdaki üç örneğe baktığımızda:

1. Potasyum sitrat assay testinde, 200 mg numune ve 0.1 N perklorik asit kullanılmaktadır [1]. Bu kombinasyona göre %100’lük bir assay sonucu elde edildiğinde dönüm noktası yaklaşık olarak 19-20 mL civarında gelmektedir. 20 mL hacimli bir büret kullanan yarı-otomatik veya otomatik titrasyon için 100 mg potasyum sitrat ideal örnek miktarı olarak değerlendirilebilir.
2. Kalsiyum hidroksit assay testinde, 500 mL’lik bir stok çözeltisi hazırlamak için 1.5 gr numune kulla-nılmaktadır. Bu stok çözeltiden titrasyon için 50 mL kullanılmakta ve böylece bu bölüntü 0.15 g numuneye karşılık gelmektedir [2]. 0.05 M disodyum EDTA titrantı kullanıldığında ve %100’lük bir saflık sonucu elde edildiğinde dönüm noktası yaklaşık olarak 40 mL civarına denk gelecektir. 10 mL civarında bir dönüm noktası elde edebilmek için stok çözeltisinde kullanılacak numune miktarının 0.375 g olarak alınması uygun bir çözüm olacaktır.
3. Potasyum bromürün klor limiti testinde, testin geçebilmesi için 1.7 mL’den fazla gümüş nitrat titrantının kullanılmaması gereklidir [3]. Bu nedenle numune miktarında ayarlama yapılmasına gerek yoktur. Öte yandan, 1.7 mL sarfiyatın ekivalens noktası için tavsiye edilen minimum %10’luk büret sarf seviyesinden daha düşük kalması nedeni ile 20 mL hacimli bir büret yerine 10 mL hacimli bir büret kullanımının tercih edilmesi uygun bir seçim olacaktır.

Yukarıdaki ayrıntıların değerlendirilmesinin ardından, söz konusu manuel titrasyonları yarı-otomatik veya otomatik titrasyona dönüştürme sürecinde gerçekleştirilmesi gereken son bir adım daha kalmaktadır: Titrasyon modu ve ilgili parametrelerin seçimi.

Titrasyon Modunun Seçilmesi

Farklı titrasyonların farklı titrant ve elektrot seçimine ihtiyaç duymaları ile benzer bir şekilde, titrasyon modu ve titrasyon parametre ayarlarının seçimi de sonuçların hassasiyet ve doğruluğu üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilmektedir. Bu nedenle otomatik ve yarı-otomatik titratör tedarikçileri, çeşitli titrasyon tipi, titrant ve sensör kombinasyonları için varsayılan ön-tanımlı titrasyon metotları sunmaktadır. Titrasyon modu, titrantın ekleme prensibini (Örn. monoton veya dinamik ekleme) ve titrasyon eğrisi kayıt biçimini (dönüm noktası veya tüm titrasyon eğrisi) tanımlamaktadır. En yaygın titrasyon modları, dönüm noktası titrasyonu, monotonik titrasyon ve dinamik titrasyon olarak öne çıkmaktadır. Aşağıda bu titrasyon modları hakkında kısa açıklamalar bulabilirsiniz. Farklı titrasyon modları ve yarı-otomatik ve otomatik titrasyonlar ile ilgili temel örnekler hakkında daha fazla bilgiye titratör tedarikçileri tarafından sağlanan literatürden erişebilirsiniz.

Dönüm Noktası Titrasyonu

Dönüm noktası titrasyonları, manuel titrasyonlara eşdeğerdir. Titrant ilavesi indikatör renk değiştirene ve dönüm noktasını gösterene kadar devam eder. Dönüm noktası titrasyonlarının temeli, indikatörün her zaman aynı dönüm noktasında güvenilir ve tekrarlanabilir olarak renk değiştirmesi (Örn. önceden tanımı bir pH değerinde) prensibine dayanmaktadır. Otomatik titrasyonlar için de bu prensip aynen uygulanır; sensör dönüm noktasını tespit edene dek titrant ilavesi devam eder. Asit-baz titrasyonları kolayca dönüm noktası titrasyonlarına dönüştürülebilmektedir. Tipik bir örnek olarak, USP <301>Acid-neutralizing Capacity [4] alınabilir. Kolay ve hızlı olmaları nedeniyle, dönüm noktası titrasyonları genellikle rutin analizler için kullanılmaktadır. Tespit sinyalinin güvenilir ve tekrarlanabilir bir dönüm noktası titrasyonu sağlayabilecek seviyede stabil olmadığı durumlarda, örnek hakkında daha fazla bilgi edinilmesi istendiğinde veya aynı titrasyon dahilinde birden fazla analit tespit edilmesi söz konusu olduğunda ise tüm titrasyon eğrisinin kaydedilmesi gerekli olacaktır. Tüm titrasyon eğrisi kayıt edilirken titrant ilavesi için iki farklı dozajlama prensibi uygulanabilmektedir: monotonik veya dinamik titrant ekleme. Şekil 2 söz konusu bu iki farklı dozajlama prensibini göstermektedir.

Monotonik Titrasyon

Titrant ilavesi için sabit hacim adımları kullanıldığında, bu titrasyona monotonik titrasyon adı verilmektedir. Monotonik titrasyon modu genellikle yavaş reaksiyon kinetiğine sahip titrasyonlar (Örn. yavaş reaksiyon veren kompleksometrik titrasyonlar) veya düşük titrant sarfiyatı beklenen analizler (Örn. kör tespitleri) için önerilmektedir. Titrasyon eğrisinin S şekline sahip olmadığı durumlarda da (Örn. redoks titrasyonları veya fotometrik sensör kullanan titrasyonlar) monotonik titrasyon kullanılmaktadır. Bu tür analizlerde dinamik titrant ekleme genellikle örneği aşırı titre etme sonucunu doğurmaktadır. Monotonik titrasyonun dezavantajları, ekivalens noktası noktası etrafındaki veri yoğunluğunun düşük olması (Bkz. Şekil 2 ve Şekil 3) ve analizin uzun sürmesidir.

 Dinamik Titrasyon

Dinamik bir titrasyon esnasında, adından da anlaşılacağı gibi titrant titrasyon eğrisinin eğimine bağlı olarak dinamik bir şekilde ilave edilmektedir. Örneğin, sinyal birkaç ekleme boyunca az bir değişim gösterirse takip eden eklemelerin hacmi artacak, aynı şekilde herhangi bir ekleme sonrası sinyal değişimi artarsa takip eden eklemelerin hacmi otomatik olarak azalacaktır. Dinamik titrasyon bu açıdan manuel titrasyona benzemektedir. Çünkü analist renk değişikliklerinin görünmesine bağlı olarak titrant ekleme hızını hızlandırmakta veya yavaşlatmaktadır. Bu yöntemin en büyük avantajı, ekivalens noktası etrafında yüksek veri yoğunluğu elde edilmesi (Bkz. Şekil 4) ve böylece daha yüksek çözünürlük, daha yüksek tekrarlanabilirlik ve daha hızlı bir titrasyon gerçekleştirilebilmesidir. Tipik olarak asit-baz titrasyonları, çöktürme titrasyonları ve kompleksometrik titrasyonlar bu titrasyon modunda gerçekleştirilmektedir. Tablo 2, en yaygın titrasyon modlarına ve prensiplerine genel bir bakış sağlamakta ve farklı titrasyon modları için en yaygın kullanımları da listelemektedir. İncelememizde yer alan her üç titrasyon örneği de -potasyum sitrat, kalsiyum hidroksit ve potasyum bromür - dinamik titrasyon modu kullanılarak titre edilebilmektedir. Öte yandan, düşük kör değerleri beklendiği için, potasyum sitrat ve kalsiyum hidroksit analizleri için kör tespitlerinin monotonik titrasyon modunda gerçekleştirilmesi önerilmektedir. Potasyum bromürün klor limiti assay testi parçasal bir titrasyon olduğundan kör analiz için dinamik titrasyon modu seçilebilmesi mümkündür.

Sonuç

Elektrot ve titrasyon modu seçimi gibi önemli noktalar doğru şekilde değerlendirildiğinde, bir manuel titrasyon metodunun yarı-otomatik veya otomatik bir titrasyon yöntemine başarılı bir şekilde dönüştürülmesi mümkündür. Titrasyon metodunun uyarlanması, titrant sarfiyatı ve ilgili atık yönetimi gibi metot optimizasyonlarının değerlendirilmesi açısından da önemli fırsatlar sağlamaktadır. İnceleme yazımızda işlemiş olduğumuz üç analiz örneği ele alındığında bu manuel titrasyonları yarı-otomatik veya otomatik titrasyon metotlarına dönüştürmek için aşağıdaki değişikliklerin gerekli olduğu görülmektedir.

1. Potasyum Sitrat Assay Testi

• Kristal viyole indikaörü yerine susuz ortam titrasyonlarına uygun bir kombine pH elektrodu kullanımı.
• Elektrodu uygun seviyede daldırabilmek için glasiyel asetik asit hacminin artırılması.
• Numune miktarının 200 mg’dan 100 mg seviyesine düşürülmesi.
• Dinamik titrasyon modunun kullanımı.

2. Kalsiyum Hidroksit Assay Testi

• Hidroksi naftol mavisi indikaörü yerine bir kombine Ca iyon-selektif elektrot kullanımı.
• Numune miktarının 1,5 g’dan 0,375 mg seviyesine düşürülmesi.
• Dinamik titrasyon modunun kullanımı.

3. Potasyum Bromürün Klor Limiti Testi

• Demir amonyum sülfat indikaörü yerine bir kombine gümüş elektrot kullanımı.
• Elektrodu uygun seviyede daldırabilmek için su hacminin artırılması.
• Dinamik titrasyon modunun kullanımı.

Söz konusu değişiklikler, elde edilen yarı-otomatik veya otomatik titrasyon metotlarının validasyonunu gerekli kılmaktadır. USP General Chapter <1225>Validation of Compendial Procedures, bir metot validasyonu esnasında hangi parametrelerin test edilmesi gerektiğine dair bir taslak sağlamaktadır [5]. Titrasyon gibi önceden belirlenmiş genel prosedürler için, doğruluk, kesinlik ve özgüllük (olası interferans yokluğu) tespitleri gerçekleştirilerek kullanıma uygunluğun doğrulanması yapılmalıdır. Numune miktarı değiştirildiğinde linearite tespiti de gerçekleştirilmelidir. Metrohm olarak, titrasyon alanında 75 yılı aşkın tecrübemiz ve sektörün standartlarını belirleyen benzersiz teknolojilerimiz ile ilaç üretim, kalite kontrol ve Ar-Ge süreçlerinizi geliştirebilmeniz için geniş bir yelpazede enstrümantasyon ve uygulama seçenekleri sunmaktayız. Uluslararası farmakopeler ile %100 uyumlu analitik çözümlerimiz ile aktif ilaç bileşenlerinden (API), eksipiyanlar, impüriteler, başlangıç maddeleri ve bitmiş farmasötik ürünlere (FPP) kadar uzanan tüm uygulama ihtiyaçlarınız için yanınızdayız.

Kaynaklar

1.Metrohm White Paper WP 063EN_2021-03 “Recommendations for Converting a Manual Titration Procedure into an Automated Titration Procedure” [1] USP. Potassium Citrate. In: USP 42–NF 37. Rockville, MD: USP; 2020:3613. [2] USP. Calcium Hydroxide. In: USP 42–NF 37. Rockville, MD: USP; 2020:701. [3] USP. Potassium Bromide. In: USP 42–NF 37. Rockville, MD: USP; 2020:3600. [4] USP. Acid-neutralizing Capacity. In: USP–NF. Rockville, MD: USP; May 1, 2019. [5] USP. Validation of Compendial Procedures. In: USP–NF. Rockville, MD: USP; May 1, 2019