E.Coli Scale-Up Fermantasyonu: 500 Ml Minibio’dan 3 L Laboratuvar Biyoreaktörüne

13.11.2017

Özet:

Biyoproses ölçeklendirme (scale-up), yeni veya geliştirilmekte olan bir prosesin laboratuvar ölçeğinden üretim ölçeğine aktarılması anlamına gelmektedir. Maliyeti düşürmek için küçük ölçekli bir biyoreaktör kullanılarak büyük ölçekli koşulların taklit edilmesi bir biyoprosesi iyileştirmenin ilk adımıdır. Bu çalışmada, Applikon’un 500 mL ve 3 L’lik nominal hacimlerdeki biyoreaktörlerinde tipik bir E. coli fermantasyonu gerçekleştirilmiş ve küçük ölçekten büyük ölçeğe scale-up çalışmaları yapılmıştır. Her iki biyoreaktör için de aynı kültür (cultivation) koşulları kullanılmıştır. Sonuçlar optik yoğunluk (OD600) ölçümleri ve proses kontrolü temel alınarak değerlendirilmiş; parametre kontrolü (pH, T, dO2) ve hücre büyüme profilinin her iki ölçekte de aynı davranış sergilediği gözlemlenmiştir.

Giriş

Antibiyotikler, alkoller, amino asitler, enzimler ve organik asitler gibi birçok biyoteknolojik ürünün ticari olarak üretimi için başlangıç noktası,küçük hacimli laboratuvar biyoreaktörlerinin yüz binlerce litrelik biyoreaktör ölçeklerine uygun olarak optimize edilmesidir. Ölçeklendirme işlemi sırasında aynı fiziksel ve kimyasal koşulların sağlanması önemlidir. Kimyasal koşullar pH,çözünmüş oksijen seviyesi,besiyeri konsantrasyonu ve toksik metabolitlerin konsantrasyonunu içermektedir. Fiziksel koşullar ise biyoreaktör konfigürasyonu ve uygulanan güç ile ilgilidir. Biyoproses optimizasyonu amacıyla kısa zamanda çok veri elde edilmesi için küçük ölçekli fermentörler tercih edilmektedir. STR tip biyoreaktörler arasında ölçeklendirme için kullanılan stratejilerden biri, aşağıdaki eşitlik (1) uyarınca benzer geometrik konfigürasyon oluşturulmasına dayanmaktadır: DT2 / DT1 = (VL2 / VL1) 1/3 DT: kültür kabının iç çapı, VL: çalışma hacmi; 1 ve 2: biyoreaktörler Bu çalışmada, iki küçük ölçekli fermentör arasındaki ölçeklenebilirlik test edilmiştir. Aynı gaz verme stratejilerinin uygulanabilmesi için spargerlar,impellerlar ve sabit kültür kabı oranları kullanılmıştır. Bu amaçla, tipik bir E. coli fermantasyonu, toplam hacmi 3 L olan 2 L çalışma hacimli bir laboratuvar biyoreaktörü ve toplam hacmi 500 mL olan 400 mL çalışma hacimli bir biyoreaktör kullanılarak gerçekleştirilmiştir.Scale-up çalışmalarında geleneksel olarak 3 L’lik laboratuvar biyoreaktörü kullanılmaktadır. Bunun nedeni bu hacimdeki biyoreaktörün karıştırarak havalandırma,karıştırma türleri ve parametreleri açısından büyük ölçekli olanlara daha fazla benzemesidir. Öte yandan, 500 mL biyoreaktör daha az tezgah alanı ve daha az besiyeri gerektirmektedir. Aynı zamanda küçük hacmi sayesinde daha küçük hacimli bir otoklav ile daha hızlı otoklavlanabilmektedir. Bu çalışmanın amacı 3 L ve 500 mL biyoreaktör arasındaki ölçeklenebilirliği araştırmak, proses parametrelerini ve kültür (cultivation) sırasında elde edilen büyüme profillerini değerlendirmektir.

Malzemeler ve Yöntemler

E. coli fermantasyonları 3 L ve 500 mL biyoreaktörlerde gerçekleştirilmiştir. Her iki biyoreaktör için de aynı konfigürasyon, aynı pre-kültür ve besiyeri ile kullanılmıştır.Ayrıca pH, çözünmüş oksijen (dO2) ve sıcaklık gibi parametreler de her iki sistem için eşdeğer olarak kontrol edilmiştir. Proses esnasındaki biyokütle büyümesi, 600 nm’deki optik yoğunluk (OD600) farklı zamanlarda ölçülerek takip edilmiştir.

A. Geometrik benzerlik

İki kültür kabı arasındaki benzer geometriyi teyit etmek için yukarıda anlatılan eşitlik (1) kullanılmıştır: 1- 3 L kültür kabı DT1 – 130 mm VL1- 2000 mL D T 2 / DT1 = (VL2 / VL1)1/3 2- 500 mL kültür kabı DT2 – 71 mm VL2- 400 mL

B. Mikroorganizma ve Medya

• Pre-kültür olarak plazmid içermeyen E. coli K12, LB ortamında gliserol stokundan yetiştirilmiştir. Pre-kültür, bir rezonans akustik inkübatör (RamBio,Applikon Biotechnology) içinde, 30ºC’de 16 saat süreyle yetiştirilmiştir. • E. coli fermantasyonu için besiyeri olarak LB 2x (20g / L tripton; 10 g / L maya özütü; 20 g / L NaCl) kullanılmıştır.Tüm besiyeri bileşenlerinin çözünmesinden sonra, NaOH 0.1 M çözeltisi ile pH 7’ye ayarlanmıştır. • Biyoreaktörler, OD600 değerinin 0.2 olduğu an başlangıç noktası alınarak, aynı pre-kültür kullanılarak inoküle edilmiştir. C. 500 mL MiniBio • E. coli’nin batch fermantasyonu için toplam hacmi 500 mL olan 400 mL çalışma hacimli bir cam otoklavlanabilir biyoreaktör (ApplikonBiotechnology)kullanılmıştır. Biyoreaktörün proses kontrolünde,bu amaca yönelik özel bir yazılım olan my-control(Applikon Biotechnology)kullanılmıştır. Biyoreaktör konfigürasyonu Şekil 1A’da gösterilmektedir. Kültür kabı konfigürasyonunda 2 rushton impeller,bir L-tipi sparger,DO2, pH ve sıcaklık sensörleri, numune alma septumu ve pH kontrolü için bir sıvı ekleme portu bulunmaktadır. • Numuneler, örnekleme septumu boyunca 0.2 mL kültürün steril bir şırınga yardımı ile çekilmesiyle alınmıştır. Optik yoğunluk (OD), spektrofotometre ile 600 nm’de ölçülmüştür

D. 3 L Biyoreaktör

• E. coli’nin batch fermantasyonu için toplam hacmi 3 L olan 2 L çalışma hacimli bir cam otoklavlanabilir biyoreaktör (Applikon Biotechnology) kullanılmıştır.Biyoreaktörün proses kontrolünde, bu amaca yönelik özel bir yazılım olan Ez-control (Applikon Biotechnology) kullanılmıştır. Biyoreaktör konfigürasyonu Şekil 1B’de gösterilmektedir. Kullanılan insert’ler, 500 mL biyoreaktördeki ile aynıdır. Biyoreaktör, dO2, sıcaklık ve pH sensörleri ile kurulmuş ve bu parametreler, Ez-control (Applikon Biyoteknoloji) yazılımı ile kontrol edilmiştir. Havalandırma açık borulu L tipi sparger ile gerçekleştirilmiştir.Kültür kabı konfigürasyonunda 2 rushton impeller,numune alma septumu ve pH kontrolü için ilave port bulunmaktadır. • Numuneler, örnekleme septumu boyunca 1.0 mL kültürün steril bir şırınga yardımı ile çekilmesiyle alınmıştır. Optik yoğunluk (OD), spektrofotometre ile 600 nm’de ölçülmüştür.

E. Aktüatörler ve Ayar Noktaları

• dO2, her iki biyoreaktör için bir hava valfi kullanılarak,%30 hava doygunluğundan başlayarak yukarı doğru kontrol edilmiştir. • pH, amonyak sıvı çözeltisi (%25 V / V) kullanılarak pH 7.0’ye ayarlanmıştır. • Sıcaklık 37ºC olarak ayarlanmıştır. Biyoreaktör sıcaklık kontrolü, 500 mL için ısıtma / soğutma peltieri ile 3 L için ise bir ısıtma battaniyesi ve soğuk bir parmak ile sağlanmıştır. • Karıştırıcı hızı, 500 mL için 2000 rpm, 3 L için ise 1000 rpm’e ayarlanmıştır. Belirlenen koşullar için her iki biyoreaktörde ölçülen KLa yaklaşık olarak 217 saat-1 olmuştur. • Her iki kontrolörden (3 L biyoreaktör için Ezcontrol,500 mL biyoreaktör için my-control) kaydedilen parametrelerin proses değerleri, Applikon Biotechnology’nin SCADA yazılımı ile toplanmıştır.

Şekil 1A. Sıcaklık, pH ve çözünmüş oksijeni kontrol etmek için gaz girişleri ısıtma / soğutma peltieri ve sensörleri ile mini-Bio’nun konfigürasyonu.Şekil 1B. pH, sıcaklık ve çözünmüş oksijen ölçüm sensörleri ile STR tip (karıştırmalı) biyoreaktör 3 L.

Sonuçlar ve Tartışma

3 L’lik ve 500 mL’lik biyoreaktörler arasındaki ölçeklenebilirliği araştırmak için 7 saat süreyle paralel E. coli fermantasyonları gerçekleştirilmiştir.Farklı zaman noktalarında ölçülen optik yoğunluk (OD) sonuçları Şekil 2’de gösterilmektedir. E.Coli Scale-Up

Şekil 2. E. coli büyümesinin yarı logaritmik gösterimi. Gösterilen optik yoğunluk değeri, zaman noktasındaki optik yoğunluğun doğal log’unun başlangıçtaki optik yoğunluğa bölünmesi ile elde edilmiştir. Eksponansiyel fazda elde edilen büyüme hızları 3L’lik biyoreaktör için 0.854 ve 500 mL’lik biyoreaktör için 0.859 olmuştur. 7 saatlik batch fermantasyon sonrasında elde edilen büyüme eğrilerinin her iki ölçek için de benzer olduğu görülmüştür.3 L ve 500 mL fermantörlerde elde edilen son biyokütle sırasıyla 7.12 ± 0.07 ve 6.81 ± 0.09 olarak gerçekleşmiştir. Bu çalışmanın sonuçları, 3 L ve 500 mL’lik biyoreaktörlerdeki büyüme koşullarının birbirine yakın ve kendi aralarında tekrarlanabilir olduğunu göstermiştir. Her iki ölçek için de aynı KLa değerinin elde edilebilmesi ve iki kültür kabının benzer geometride olması, söz konusu konfigürasyonların yukarı ve aşağı ölçeklendirme (scale-up/down) için uygun olduğunu göstermiştir.

Kontrol Edilen Parametreler

Şekil 3A, 3B ve 3C’de ez-control (3 L biyoreaktör) ve my-control (500 mL biyoreaktör) ile kontrol edilen parametreler arasındaki karşılaştırma gösterilmektedir. E.Coli Scale-Up

Şekil 3A. ez-control ve hava valfinin aktüatör olarak kullanıldığı 3 L’lik biyoreaktördeki çözünmüş oksijen (hava satürasyonu %’si)- mavi çizgiler; my-controlve hava valfinin aktüatör olarak kullanıldığı 500 mL’lik biyoreaktördeki çözünmüş oksijen (hava satürasyonu %’si)-yeşil çizgiler.dO2, 7 saatlik batch fermentasyon süresince, hava kullanılarak %30’a ayarlanmıştır. Şekil 3A’daki sonuçlar, beklenildiği üzere, parametrenin ayarlandığı noktada iyi bir kontrol sağlandığını göstermiştir. İki farklı ölçekli biyoreaktörde iki farklı kontrolör arasındaki karşılaştırma, hem Ez-control’ün hem de my-control’ün süreç boyunca parametreleri başarıyla kontrol edebildiğini göstermiştir. Ayrıca, toplanan veriler, kültürün iki farklı ölçekte aynı büyüme davranışında olduğunu göstermiştir. Bu sonuçlar,3 L ve 500 mL biyoreaktörler arasındaki ölçeklenebilirliğin başarısını güçlendirmektedir. E.Coli Scale-Up

Şekil 3B. ez-control ve bir alkali peristaltik pompanın aktüatör olarak kullanıldığı 3 L’lik fermentördeki pH-mavi çizgiler; my-control ve hava valfinin aktüatör olarak kullanıldığı 500 mL’lik biyoreaktördeki pH-yeşil çizgiler. Şekil 3B’de fermantasyon boyunca pH profili gösterilmektedir. Ayar noktası pH 7 iken, kültür süresince yalnızca yukarı doğru kontrol için bir aktüatör kullanılmıştır, yani pH, bakteri gelişimi sırasında üretilen asit nedeniyle oluşan pH değerine düştüğünde baz çözeltisi ilave edilmiştir. pH döngüsünde aşağı kontrol için bir aktüatör bulunmaması,pH değerinin neden ayar noktasının üstünde olduğunu açıklamaktadır. Batch fermantasyon sırasında gözlemlenen pH değerlerinin yakınlığı, (ayar noktasının üstünde) özel olarak hiçbir kontrol olmadığında,her iki biyoreaktörün de aynı büyüme koşullarını sağladığını doğrulamıştır. E.Coli Scale-Up

Şekil 3C. ez-control ve soğuk parmak ve ısıtıcı battaniyenin kullanıldığı 3 L’lik fermentördeki sıcaklık-mavi çizgiler; my-control ve ısıtıcı/soğutucu peltierin kullanıldığı 500 mL’lik biyoreaktördeki sıcaklık-yeşil çizgiler. Şekil 3C, her iki sistemin sıcaklığının da 37°C’lik bir ayar noktasında kontrol edilebildiğini göstermektedir. Sıcaklık kontrolü için her iki sistemde farklı aktüatörler-500 mL bir ısıtma/soğutma peltier elemanı; 3 L biyoreaktör için ısıtma battaniyesi (ayar noktasının altında) ve soğuk parmak (ayar noktasının üstünde)- kullanılmış olsa da sistemlerde belirlenen noktada optimum sıcaklık kontrolü sağlanabilmiştir.

Sonuçlar:

• 3 L ve 500 mL’lik biyoreaktörlerde, aynı koşullar kullanılarak paralel E. coli fermantasyonları gerçekleştirilmiştir.Biyokütle sonuçları, her iki biyoreaktörün benzer bir büyüme oranına izin verdiğini göstermiştir. 3 L ve 500 mL’lik biyoreaktörler için sırasıyla 7.12 ve 6.81’lik bir OD600 elde edilmiş ve iki biyoreaktörün, %4,4’lük bir farkla, birbirine oldukça yakın biyokütle sonuçları gösterdiği gözlemlenmiştir. • İki biyoreaktörde, 3L için ez-control, 500 mL için my-control, olmak üzere, iki farklı Applikon kontrolör kullanılmıştır. İki konfigürasyon arasındaki tek fark sıcaklık kontrolüdür. Sonuçlar, farklı ölçekteki iki biyoreaktörde dO2, pH ve sıcaklık parametrelerinin mükemmel bir şekilde kontrol edildiğini ve E. coli’nin aynı seviyede büyüdüğünü göstermiştir. • Yapılan çalışmayla Applikon’un 3 L ve 500 mL biyoreaktörleri arasındaki ölçeklenebilirlik kanıtlanmış ve her iki biyoreaktörün de küçük ölçekli prosesler için güvenilir seçenekler olduğu gösterilmiştir.